细胞转染常见问题解析

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细胞转染常见问题解析

细菌转染

1.转染效率低

(1)细胞状态差或不恰当的细胞密度

建议接种生长状态良好的细胞,按转染试剂要求的最适密度接种细胞。

(2)优化转染条件

例如优化阳离子脂质体试剂和DNA的量。

(3)DNA-阳离子脂质体试剂复合物在存在血清的条件下形成
建议在复合体形成时不要使用血清。

(4)转染体系中是否存在抑制剂

建议不要在用于制备DNA-阳离子脂质体复合物的培养基中使用抗生素、EDTA、柠檬酸盐、磷酸盐、RPMI、硫酸软骨素、透明质酸,厂硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。

(5)阳离子脂质体试剂冻结

建议不要使用冻结的或储存温度低于4℃的阳离子脂质体试剂。

(6)质粒纯化的问题

建议使用转染级的质粒纯化试剂盒。

(7)可更换不同公司或不同货号的转染试剂,也可改变转染的方法例如一般病毒感染均能获得较高的转染效率。

2.细胞死亡率高

(1) DNA量太高

建议:作一个剂量-反应曲线以确定最佳的DNA量。在剂量-反应转染中加人阳离子脂质体试剂,因为单独DNA也会对细胞生长有一个基础的影响。

(2)阳离子脂质体试剂量太高

建议:作一个剂量-反应曲线以确定最佳的阳离子脂质体试剂的量。在剂量反应转染中加入DNA,因为单独阳离子脂质体试剂也只对细胞生长有一个基础的影响。

(3)在转染过程中使用抗生素

建议:在转染过程中不要使用氯霉素、青霉素或链霉素,因为阳离子脂质体试剂使细胞更敏感。

(4)细胞太少

建议:作一个剂量-反应曲线以确定每个转染过程中最佳的细胞数量。根据您的应用所要求的效率调整细胞数量。

阳离子脂质体试剂氧化了

建议:不要过分搅动或振荡阳离子脂质体试剂,这可能会形成阳离子脂质体试剂的过氧化物。

(6) 对于稳定转染,筛选抗生素加人太快或浓度太高

建议:在加入筛选性抗生素前至少要在不含G418的培养基中培养48h,使细胞表达抗性基因。

(7)可更换不同公司或不同货号的转染试剂

3.转染重复性不好

(1)转染时的融合度波动

建议:不同批次的转染时保持所有的转染参数恒定,如融合度、传代次数和生长时间相等。

(2)在培养过程中细胞发生变化

建议:如果可能,使用来源于经选择转染效率较高的亚系细胞;如果可能,用新融化的细胞进行实验。