细胞培养这个生物学研究最基础的技术之一，已经渗透进了科研工作的方方面面。本文将与大家分享一篇细胞培养的攻略，也是公司一位同事9年细胞培养经验的总结，涵盖了昆虫细胞蛋白表达常用到的sf9细胞与哺乳动物细胞蛋白表达系统的CHO细胞与HEK293细胞，主要介绍了细胞复苏、细胞传代、细胞冻存的具体操作方法。

细胞复苏：

1、细胞培养条件

细胞类型	培养基	F-68	L-Gulamine	培养温度	气体
Sf9	SFX-Insect	含0.1%	L-Gulamine	27	O2 20%
High5	Express Five SFM	含0.1%	100ml/L	27	O2 20%
293F	Freestyle293	3 ml/L	Glutamax	37	CO2 5%-8% 20%
2936E	Freestyle293	3 ml/L	Glutamax	37	CO2 5%-8%
CHO-S	FreestyleCHO	3 ml/L	40 ml/L	37	CO2 5%-8%
DG44	CD-DG44	18 ml/L	40 ml/L	37	CO2 5%-8%

2、复苏流程：

（1）确认水浴锅的水清洁可用，方可提前打开37度预热。
（2）确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置，并做好复苏登记。
（3）提前做好复苏准备，预热培养基。
（4）悬浮和贴壁细胞复苏参数：

细胞类型	预热培养基	培养器皿	是否离心	FBS
悬浮	20 ml	125 mlflask	否	是
贴壁	10 ml	T25方瓶	是1000 rpm 5 min	是

（5）将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解，1.8 ml时间大概1分30秒，1 ml大概1 min左右，需计时，期间不要老是拿起来观察，需要快速复溶，避免细胞受到损伤。
（6） 贴壁细胞需离心， 1000 rpm，5 min；悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中
（7）贴壁细胞离心后去除上清，用预热的培养基重悬细胞后加入到T25方瓶，最后放入培养箱中培养。
（8）取小样计数观察，细胞活力在70%以上算正常。低于70%活力可能细胞状态不太好，需要培养和恢复。（细胞计数具体操作）

细胞传代培养

1． 悬浮细胞传代流程：

（1） 先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台；
（2） 打开摇瓶瓶盖，用200 ul移液器取100~200 ul细胞放入1.5 mlEP管中，瓶盖过火，拧紧，将培养瓶放回摇床；
（3）将200 ul细胞混匀，取10 ul细胞加入10 ul台盼蓝，显微镜下计数。根据细胞数决定下游实验；
（4）细胞需计数两次求平均值；
（5）悬浮细胞生长参数

细胞类型	接种密度(个/ml)	传代密度(个/ml)	传代时间	倍增时间	最高密度(个/ml)
Sf9	0.4x10^6	5-6 x10^6	72 h	20h	15 x10^6
High5	0.5x10^6	3x10^6	48h	18h	5 x10^6
293F	0.5x10^6	2-3 x10^6	48h	24h	4 x10^6
2936E	0.5x10^6	2-3 x10^6	48h	24h	4 x10^6
EXPICHO	0.1-0.3x10^6	4-6 x10^6	72-96h	18h	15 x10^6

（6）根据不同细胞的生长曲线在合适的时间和密度给细胞接种传代；
以sf9细胞为例：
细胞接种密度0.4 x10^6个/ml,24 h密度1x10^6个/ml,48 h密度2.4x10^6个/ml,72 h密度6x10^6个/ml，此时需要传代细胞；要求留样100 ml0.4 x10^6个/ml具体操作如下：
计算：需要母细胞体积=100*0.4/6=6.6ml
需要培养基体积=100-6.6=93.4ml
将上面体积的细胞和培养基加入到摇瓶中，放回27度培养箱培养即可

2. 贴壁细胞传代流程：

（1） 显微镜下观察细胞状态和密度，80%汇合率以上需要传代；
（2） T25方瓶中加入0.5 ml~1 ml 0.25%胰酶溶液（需37度预热），使瓶底细胞都浸入溶液中。放入37度培养箱进行消化；
（3） 不同细胞消化时间不一样，初次培养贴壁细胞消化时间可以定在1min,显微镜下观察消化结果，消化不完全可以再适度加长消化时间；
（4）对于有经验的细胞消化可以定个准确的时间，消化结束后将培养皿放入显微镜下观察细胞，随着时间变长，原先贴壁细胞逐渐变圆，慢慢脱落，在还未飘起时弃掉胰酶，加入含有10%FBS的新鲜培养基终止消化；
（5） 用1 ml移液器轻轻吹打细胞，将细胞全部吹下后，可进行传代，一般是1：3传代；
（6） 贴壁不牢的细胞可以用0.1%的凝胶包被4℃ 30min,用PBS清洗5次。

细胞冻存

1、细胞冻存参数

细胞类型	培养基	FBS	DMSO	细胞密度（个/ml）
Sf9	60%	30%	10%	10X10^6
High5	新旧各30%	30%	10%	5 X10^6
293F	60%	30%	10%	10X10^6
2936E	60%	30%	10%	10X10^6
CHO-S	60%	30%	10%	10X10^6
DG44	60%	30%	10%	10X10^6

2、贴壁细胞冻存流程：

（1）将胰酶、培养基提前37度预热；冻存液提前配好放到4度冰箱预冷；
（2）先将装有细胞的方瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台；
（3） 打开方瓶瓶盖，将方瓶中的培养基倒干净；
（4） 根据细胞消化难易程度添加适量的胰酶；T25方瓶加1 ml胰酶,T75方瓶加2ml胰酶；
（5） 根据细胞消化难易程度放入37度培养箱消化1-5 min，知道看见大片的细胞开始脱落，要及时终止消化；
（6） 终止培养基需要含有至少10%血清，通常终止比例为1:10（1ml胰酶需要加入10 ml终止培养基），对胰酶比较敏感的细胞需要终止后离心后换新鲜的培养基；
（7） 终止后将细胞轻轻吹打混匀，避免结团，细胞收集到15 ml或者50 ml离心管中，将离心管配平，放入离心机中1000 rmp5分钟；
（8） 将离心管从离心机中取出，用酒精喷洒后拿进超净台；
（9） 弃掉离心管中上清，加入预冷的冻存液，吹打混匀；
（10） 将混匀的细胞加入冻存管中；
（11）将冻存管放入冻存盒中，最后放入-80°冰箱；
（12） 第二天把细胞转移至液氮；

3、悬浮细胞冻存流程：

（1） 先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台；
（2） 打开摇瓶瓶盖，取适量细胞放入50 ml离心管或15 ml离心管中；
（3） 将离心管配平，放入离心机中1000 rmp5分钟；
（4） 将离心管从离心机中取出，用酒精喷洒后拿进超净台；
（5） 弃掉离心管中上清，加入提前预冷的冻存液，吹打混匀；
（6） 将混匀的细胞加入冻存管中；
（7） 将冻存管放入冻存盒中，最后放入-80°冰箱；
（8） 第二天把细胞转移至液氮；

以上就是我们分享的关于细胞培养的具体内容，可能表述略显繁琐，但是只有严谨才能筑牢实验的根基，有什么想法可以咨询我们

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