细胞培养具体操作步骤

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  细胞培养这个生物学研究最基础的技术之一,已经渗透进了科研工作的方方面面。本文将与大家分享一篇细胞培养的攻略,也是公司一位同事9年细胞培养经验的总结,涵盖了昆虫细胞蛋白表达常用到的sf9细胞与哺乳动物细胞蛋白表达系统的CHO细胞与HEK293细胞,主要介绍了细胞复苏、细胞传代、细胞冻存的具体操作方法。

实验室实拍

细胞复苏:

1、细胞培养条件

细胞类型 培养基 F-68 L-Gulamine 培养温度 气体
Sf9 SFX-Insect 含0.1% L-Gulamine 27 O2 20%
High5 Express Five SFM 含0.1% 100ml/L 27 O2 20%
293F Freestyle293 3 ml/L Glutamax 37 CO2 5%-8% 20%
2936E Freestyle293 3 ml/L Glutamax 37 CO2 5%-8%
CHO-S FreestyleCHO 3 ml/L 40 ml/L 37 CO2 5%-8%
DG44 CD-DG44 18 ml/L 40 ml/L 37 CO2 5%-8%

2、复苏流程:

(1)确认水浴锅的水清洁可用,方可提前打开37度预热。
(2)确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置,并做好复苏登记。
(3)提前做好复苏准备,预热培养基。
(4)悬浮和贴壁细胞复苏参数:

细胞类型 预热培养基 培养器皿 是否离心 FBS
悬浮 20 ml 125 mlflask
贴壁 10 ml T25方瓶 是1000 rpm 5 min

(5)将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解,1.8 ml时间大概1分30秒,1 ml大概1 min左右,需计时,期间不要老是拿起来观察,需要快速复溶,避免细胞受到损伤。
(6) 贴壁细胞需离心, 1000 rpm,5 min;悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中
(7)贴壁细胞离心后去除上清,用预热的培养基重悬细胞后加入到T25方瓶,最后放入培养箱中培养。
(8)取小样计数观察,细胞活力在70%以上算正常。低于70%活力可能细胞状态不太好,需要培养和恢复。(细胞计数具体操作

细胞传代培养

1. 悬浮细胞传代流程

(1) 先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出,用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台;
(2) 打开摇瓶瓶盖,用200 ul移液器取100~200 ul细胞放入1.5 mlEP管中,瓶盖过火,拧紧,将培养瓶放回摇床;
(3)将200 ul细胞混匀,取10 ul细胞加入10 ul台盼蓝,显微镜下计数。根据细胞数决定下游实验;
(4)细胞需计数两次求平均值;
(5)悬浮细胞生长参数

细胞类型 接种密度(个/ml) 传代密度(个/ml) 传代时间 倍增时间 最高密度(个/ml)
Sf9 0.4x10^6 5-6 x10^6 72 h 20h 15 x10^6
High5 0.5x10^6 3x10^6 48h 18h 5 x10^6
293F 0.5x10^6 2-3 x10^6 48h 24h 4 x10^6
2936E 0.5x10^6 2-3 x10^6 48h 24h 4 x10^6
EXPICHO 0.1-0.3x10^6 4-6 x10^6 72-96h 18h 15 x10^6

(6)根据不同细胞的生长曲线在合适的时间和密度给细胞接种传代;
以sf9细胞为例:
细胞接种密度0.4 x10^6个/ml,24 h密度1x10^6个/ml,48 h密度2.4x10^6个/ml,72 h密度6x10^6个/ml,此时需要传代细胞;要求留样100 ml0.4 x10^6个/ml具体操作如下:
计算:需要母细胞体积=100*0.4/6=6.6ml
需要培养基体积=100-6.6=93.4ml
将上面体积的细胞和培养基加入到摇瓶中,放回27度培养箱培养即可

2. 贴壁细胞传代流程:

(1) 显微镜下观察细胞状态和密度,80%汇合率以上需要传代;
(2) T25方瓶中加入0.5 ml~1 ml 0.25%胰酶溶液(需37度预热),使瓶底细胞都浸入溶液中。放入37度培养箱进行消化;
(3) 不同细胞消化时间不一样,初次培养贴壁细胞消化时间可以定在1min,显微镜下观察消化结果,消化不完全可以再适度加长消化时间;
(4)对于有经验的细胞消化可以定个准确的时间,消化结束后将培养皿放入显微镜下观察细胞,随着时间变长,原先贴壁细胞逐渐变圆,慢慢脱落,在还未飘起时弃掉胰酶,加入含有10%FBS的新鲜培养基终止消化;
(5) 用1 ml移液器轻轻吹打细胞,将细胞全部吹下后,可进行传代,一般是1:3传代;
(6) 贴壁不牢的细胞可以用0.1%的凝胶包被4℃ 30min,用PBS清洗5次。

细胞冻存

1、细胞冻存参数

细胞类型 培养基 FBS DMSO 细胞密度(个/ml)
Sf9 60% 30% 10% 10X10^6
High5 新旧各30% 30% 10% 5 X10^6
293F 60% 30% 10% 10X10^6
2936E 60% 30% 10% 10X10^6
CHO-S 60% 30% 10% 10X10^6
DG44 60% 30% 10% 10X10^6

2、贴壁细胞冻存流程:

(1)将胰酶、培养基提前37度预热;冻存液提前配好放到4度冰箱预冷;
(2)先将装有细胞的方瓶从培养箱拿出,用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台;
(3) 打开方瓶瓶盖,将方瓶中的培养基倒干净;
(4) 根据细胞消化难易程度添加适量的胰酶;T25方瓶加1 ml胰酶,T75方瓶加2ml胰酶;
(5) 根据细胞消化难易程度放入37度培养箱消化1-5 min,知道看见大片的细胞开始脱落,要及时终止消化;
(6) 终止培养基需要含有至少10%血清,通常终止比例为1:10(1ml胰酶需要加入10 ml终止培养基),对胰酶比较敏感的细胞需要终止后离心后换新鲜的培养基;
(7) 终止后将细胞轻轻吹打混匀,避免结团,细胞收集到15 ml或者50 ml离心管中,将离心管配平,放入离心机中1000 rmp5分钟;
(8) 将离心管从离心机中取出,用酒精喷洒后拿进超净台;
(9) 弃掉离心管中上清,加入预冷的冻存液,吹打混匀;
(10) 将混匀的细胞加入冻存管中;
(11)将冻存管放入冻存盒中,最后放入-80°冰箱;
(12) 第二天把细胞转移至液氮;

3、悬浮细胞冻存流程:

(1) 先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出,用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台;
(2) 打开摇瓶瓶盖,取适量细胞放入50 ml离心管或15 ml离心管中;
(3) 将离心管配平,放入离心机中1000 rmp5分钟;
(4) 将离心管从离心机中取出,用酒精喷洒后拿进超净台;
(5) 弃掉离心管中上清,加入提前预冷的冻存液,吹打混匀;
(6) 将混匀的细胞加入冻存管中;
(7) 将冻存管放入冻存盒中,最后放入-80°冰箱;
(8) 第二天把细胞转移至液氮;

以上就是我们分享的关于细胞培养的具体内容,可能表述略显繁琐,但是只有严谨才能筑牢实验的根基,有什么想法可以咨询我们 在线QQ技术支持2

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