细胞培养常见问题解析

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1、细胞生长缓慢

(1)新老批次血清可能存在差异,增大细胞初始接种密度,使细胞逐步适应新的培养基。
(2)必需生长促进成分(如L-谷氨酰胺或生长因子)耗竭、缺乏或分解:去除原培养基,加入新鲜培养基;向培养基中添加生长促进成分(如L-谷氨酰胺)。
(3)时间存储不当:血清应于-5℃至-20℃下储存;培养基应于2℃~8℃下避光储存;尽量减少血清和培养基见光时间。
(4)细胞初始接种密度低:增大活细胞接种密度。
(5)细胞衰老、老化:将老化细胞丢弃,取用代数较少的细胞。

2、如何进行细胞计数?

  细胞计数的原则是数上不数下,数左不数右,结团细胞数到能看得见的细胞为止,实在结团严重,按照计数的2-3倍的密度稀释传代,添加抗结团剂,详情见细胞计数具体操作过程

细胞计数

3、细胞污染有哪些?该如何处理?

  细胞的污染种类有很多,包括细菌、真菌、支原体、病毒、异种培养物和化学物质等。那么首先就得对细胞污染进行判断

(1)真菌污染:一般在培养液中有肉眼容易识别的白色或浅黄色的漂浮小点,念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间,个体细小,有增多趋势,培养液一般不混浊;倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝交错,有的呈链状排列。最有效的预防方式是加入抗真菌剂。
(2)细菌污染:较为常见,用相差显微镜观察到满视野点状颗粒,培养背景由清晰变得模糊,甚至大量的细菌可以覆盖细胞。细胞停止生长且发生病理改变。 可以取10ml细胞悬液1000rpm离心5min,沉淀中加入2ml无抗生素培养液,将细胞置于培养箱培养。若培养物受细菌污染,24~48小时内可以获得阳性结果。联合使用青霉素、链霉素等抗生素对预防细菌污染有效。
(3)支原体污染:支原体肉眼不可见,无细胞壁,形态多变,对理化因素比较敏感。显微镜下观察无特殊外观表现,培养液也不浑浊;部分敏感细胞生长增殖变慢,细胞变圆,脱落。支原体可通过培养法、DNA荧光染色法、聚合酶链式反应、免疫学等方法进行检测。在细胞培养过程中,如在显微镜下发现破碎的细胞有许多,培养物需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时,那么细胞可能受支原体污染。
(4)病毒污染:新引入的细胞系、天然产物(如血清)和胰蛋白酶均是潜在的病毒污染来源。感染了病毒的宿主细胞形态学上不一定有显著的特异性的改变,应用电子显微镜观察或进行免疫学染色可判断细胞是否被病毒污染。
(5)其它污染:一些温度、辐射等对细胞的物理干扰,细胞交叉污染,还有一些因清洗消毒不当带来的一些化学污染,

污染的排除:

一般应尽快将污染细胞与正常细胞系隔离,弃去污染的细胞,非常重要的细胞株可以考虑去除污染,但是污染被完全去除在任何情况下都是及其困难的。 (1)细菌污染的排除:向污染的细胞培养液中加入大剂量的抗革兰氏阳性和阴性细菌的抗生素,一般采用5~10倍于常用量进行用药,加入高浓度抗生素后作用24-48小时,再换入常规的培养液,有时可以奏效。 (2)支原体的排除:卡那霉素、庆大霉素、支原体去除因子、卷须霉素及BM-Cycline等对抗支原体是有活性的,可使用它们抑制或消除支原体。

4、细胞死亡的原因及对应措施

(1)培养箱中无CO2:监测培养箱中CO2使用速度以便确定及时更换气瓶;经常检测管路连接处是否漏气;不要频繁开启培养箱门。
(2)培养箱内温度有波动:监测培养箱内温度,及时校正。
(3)使用抗生素达到毒性浓度:减少抗生素的用量;使用无血清培养基时,抗生素浓度应降低至1/10。
(4)细胞复苏或冻存时受到损伤:更换新的细胞。
(5)培养基的渗透压不合适:检查完全培养基的渗透压。大多数哺乳动物细胞可耐受260~350mOsm/kg的渗透压,加入某些试剂和药物后会影响培养基的渗透压;昆虫细胞培养基的渗透压(340~380mOsm/kg)要高于哺乳动物细胞。
(6)培养基中毒性代谢产物蓄积:去除原培养基,换用新鲜培养基。

5、培养细胞不贴壁怎么办?

  首先得找到细胞不贴壁的原因,一般有如下4种原因
(1)过量的胰酶消化,可以减少胰酶浓度或消化时间
(2)培养基中无粘附因子,可以增加粘附因子
(3)细胞污染
(4)细胞老化,可以启用新的保种细胞

6、细胞成团状悬浮

(1)可能是钙、镁离子的存在,用无钙镁离子的平衡盐溶液清洗细胞
(2)细胞接触抑制或者废物堆积导致细胞进入衰退期,细胞状态变差就成团飘了
(3)支原体污染,国内很多培养基血清没有做支原体阴性检测。

7、Sf9昆虫细胞培养的时候要注意哪些问题?

(1)昆虫细胞的培养条件与具体培养步骤可见细胞培养具体过程
(2)对于大部分鳞翅类昆虫细胞系, PH值 6.0-6.4会是一个比较理想的范围。培养鳞翅类昆虫细胞系时,培养基的渗透压最好在 345-380mOsm/kg。
(3)贴壁昆虫细胞:健康状态最好的细胞是对数期收获的细胞,因为细胞密度低于汇合状态的 20% 时,细胞生长会受到抑制。故昆虫细胞应在对数期传代。但是,如果培养的是强贴壁性昆虫细胞,则应在细胞达到汇合状态或者刚刚开始从培养瓶底部脱离时进行传代,此时细胞容易脱离。
(4)某些昆虫细胞系可能需要一定的过程来适应悬浮培养。进行细胞悬浮培养时无需更换培养基。定期传代时需要吸出细胞悬液,然后加入适量培养基,将细胞稀释到适当的密度。添加新鲜培养基后可使细胞营养素达到完全补充。
(5).贴壁昆虫细胞在无血清培养条件下,昆虫细胞与基质贴附极为牢固,可以采用拍掌的动作快速振摇一下培养瓶。为了避免污染,进行 此操作前必须盖紧盖子。
(6)建议不要剧烈摇晃培养瓶,因为这样可能会造成细胞损伤。

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