细胞冻存与复苏经验分享

  ◎当前位置:首页>>技术服务>>重组蛋白表达服务>>细胞冻存与复苏经验分享

  在真核系统蛋白表达与纯化中,x细胞培养是实验的根基。本文讲述了细胞培养中冻存与复苏的一些技巧与心得,虽然部分内容可能有些老生常谈,但是均来源于我们的实际经验,不管是刚上路的新手,还是多年的老手,希望对大家有一些帮助。

实验室实拍

1.细胞冻存

  就冻存细胞而言,为了防止细胞在温度下降时产生胞内细微冰晶,其温度的下降不能太快。标准的操作是每一分钟下降一度。有以下三种建议:
(1)优先推荐使用程控降温仪。
(2)其次,加有异丙醇的细胞冻存盒,基本上也可以保证每分钟1℃左右的降温速度;
(3)最后,还有一些普遍的简易冻存方法。如4℃半小时,-20 ℃半小时,然后-80 ℃过夜,再放入液氮;用泡沫盒(装15mL离心管的那种)加一个保鲜袋,直接放在-80 ℃冻存;也可以用纱布做成袋子,将细胞悬挂在液氮上方,隔天转入液氮;在冻存管外面包上棉花,直接放在 -80℃冰箱就能够达到缓慢降温的效果;有的时候如果确实比较紧急的话,向96孔冻存盒的内部加满自来水,再将冻存管放置孔中,直接置于-80 ℃,这样也能够达到缓慢降温的目的。

  根据我们的经验,细胞复苏以后活性还是比较高的。当然,如果要长时期冻存的话,必须转移至液氮罐中。

  以前在另一家实验室的时候,冻存细胞根本就没有讲究这些标准操作。冻存的细胞有293T、PT67、C2C12、MEF (鼠胚胎成纤维细胞)、Hela S3、Hela D、U2OS、HKC、RK3E、ECO、H292、HSY、COS7、SupT1 等。将细胞酶消化后直接参与离心,加入冻存液(含90%的血清和10%的DMS0),直接放在-80℃冰箱。两三天后移入液氮中,永久保存,几年后细胞的活力仍没有什么受损,照常能复苏,成活率高。 但有三点须注意: (1)第一是细胞的生长状态要好,不能长得过稀,同样也不能过密,细胞的状态看起来相当健康。70%密度的要保存的细胞须再长24 h才能全满,万一细胞状态不好,可以酶消化后再繁殖一次; (2)冻存细胞的量要留心,不能太密也不能太稀,一般1OOmm培养皿的细胞冻存为3~4管; (3)存放在-80℃冰箱的时间不能过长,一两天后转移到液氮罐里。我们也曾取出存放在-80℃冰箱的细胞,半年还有30% ~50%的细胞有活性,但一年的细胞就没有活的。

所以,冻存细胞要考虑的因素还是不少。当时实验室有一个高手,曾将长在100 mm培养皿的细胞酶消化后,用10 mL长生的培养基重悬,加入1.1 mL的DMSO,将细胞分成20管,一次性冻存于-80 ℃冰箱,半年后这位老兄还在用这些细胞,效果也不差。他懒得一次又一次地繁殖细胞,等到要用细胞时复苏一管,培养两三天后就可以用。这样看来,各人有各招,能行就可以。

2.细胞复苏

  不同的实验室有不同的方法,但基本原则是一样的,就是升温要快。从液氮中取出细胞后,马上置于37 ℃的水浴中,有时都能听到冻存管发出“啪啪”的声音,甚至会爆裂冻存管的盖子。但后来的操作要小心,不能一次性将细胞直接加在较大体积的新鲜培养基中,以免细胞的渗透压一时难以调节,降低细胞的存活率。特别是对于那些对渗透压比较敏感的细胞,如PT67之类的细胞。所以在复苏细胞时,操作上宜缓。我们的改进是:37℃的水浴等细胞刚刚融化,在冻存管里加入0.5倍体积的新鲜培养基,轻轻混匀,室温放置3 ~5 min,移取所有溶液到15 mL的离心管中,再加入3 ~5mL的培养基,离心后转入培养皿中,这样操作,细胞的状态比较好。

相关阅读:
细胞培养实验流程与注意事项