杆状病毒表达载体系统

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杆状病毒体系Bac-to-Bac体系重组蛋白表达服务
杆状病毒体系杆状病毒表达系统制备VLP

杆状病毒介绍

    杆状病毒是已知的感染昆虫种群最为常见的病毒,其结构为棒状衣壳蛋白包裹双链、环状、超螺旋的DNA分子。已经鉴定了超过500种分离到的杆状病毒(基于宿主分类),其中大多数杆状病毒分离自节肢动物,特别是鳞翅目昆虫,病毒形态主要有核型多角体病毒(NPV)和颗粒体病毒(GV),代表有苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)苹果蠹蛾颗粒体病毒(CpGV)。

    目前还没有找到支持GV病毒长期复制传代的细胞系,用于外源基因表达的杆状病毒载体是苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒(AcMNPV)和家蚕(家蚕)核多角体病毒(BmNPV)。重组杆状病毒已广泛用于在培养的昆虫细胞和昆虫幼虫中表达异源基因,对于大规模生产,杆状病毒表达载体系统(BEVS)具备高效高产的优势。

野生型杆状病毒的生命周期主要分为以下是三个阶段:

1. 病毒DNA合成期:这一阶段病毒使受感染的细胞准备复制病毒DNA。这一过程包括病毒附着细胞、核酸渗透入细胞、衣壳脱落、早期病毒基因表达和关闭宿主基因表达。实际的初始病毒合成在感染后0.5至6小时发生。

2. 病毒结构期:该阶段表达编码病毒DNA复制和病毒组装的晚期基因。 在感染后6至12小时,细胞开始产生细胞外病毒(EV),也称为非闭塞病毒(NOV)或芽生病毒(BV)。 EV包含通过胞吞作用进入病毒所必需的质膜包膜和糖蛋白。细胞外病毒的释放峰值在感染后18至36小时发生。

3. 病毒闭塞蛋白阶段:表达多角体蛋白和p10基因,形成封闭病毒(OV)-也称为封闭体(OB)或多面体包涵体(PIB),此时细胞裂解开始。感染后24至96小时,细胞开始产生OV,其含有核膜包膜和病毒多肽gp41和gp74,产生的多个病毒粒子并被结晶多面体基质包围。

杆状病毒介绍

    将野生型杆状病毒的多角体蛋白基因同源重组替换为目的基因或cDNA构建重组体,可用于体外感染昆虫细胞表达外源基因。外源基因在多角体蛋白和p10启动子的控制下进行表达,因此,表达重组产物代替天然存在的多角体蛋白,重组蛋白质被加工,修饰并靶向适当的细胞位置。使用同源重组的方式产生重组杆状病毒,重组成功率较低,耗时长操作复杂,成本高。现在实验和生产中通常使用位点特异性转座来获得重组杆状病毒,商业化成熟的表达体系是Invitrogen的Bac-to-Bac体系。

Bac-to-Bac体系组成:

pFastBac载体:Tn7转座子内含有多角体蛋白强启动子和多克隆位点。
DH10Bac感受态细胞:有亲本Bacmid的bMON14272和辅助质粒pMON7124。

位点特异性转座制备重组杆状病毒原理:

杆状病毒表达载体体系

    通过Tn7的位点特异性转座将外源基因插入在大肠杆菌中繁殖的杆粒DNA中,将目的基因克隆到pFastBac载体中,将重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中,该细胞含有具有mini-attTn7靶位点和辅助质粒的杆粒。在辅助质粒提供的转座蛋白存在下,pFASTBAC质粒上的mini-Tn7元件可以转座到杆粒上的mini-attTn7靶位点。含有重组杆粒的菌落通过抗生素选择和蓝/白筛选鉴定,因为转座导致lacZα基因的破坏。从含有重组杆粒的大肠杆菌中制备杆粒,然后将该杆粒用于转染昆虫细胞。