原核表达标准

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原核表达标准

  目前世界上,pET系统已成为在大肠杆菌中蛋白表达的首选。该系统成功的一个主要原因是目标基因被克隆到不为大肠杆菌 RNA 聚合酶识别的T7启动子之下,因此在加入T7RNA聚合酶之前几乎没有表达发生。克隆到 pET 载体的基因实际上是被关闭的,不会由于产生的蛋白对细胞有毒性而引起质粒不稳定。重组质粒转移到染色体上含有一拷贝由 lacUV5控制的T7 RNA 聚合酶基因的表达宿主中,并通过加入IPTG 诱导表达;也可通过 l CE6 感染原始克隆宿主菌来提供T7 RNA聚合酶。使用大肠杆菌启动子系统(如tac 、lac 、trc 、pL)有困难的许多基因已经在pET系统中稳定克隆和表达。T7 RNA聚合酶的选择性和活性使得几乎所有细胞资源都用于目标基因表达。诱导后几小时目标产物就可超过细胞总蛋白的50%。

  T7驱动表达技术以pETBlue TM系统为代表。pETBlue载体包括了pET用于表达的优点,在目标基因克隆和质粒DNA操作方面更为方便。

pETBlueTM系统

   pETBlue载体代表了新型表达载体,它具备所有受欢迎的克隆载体的最理想特点和T7驱动蛋白表达的完全功能。目标基因以相对于修饰的大肠杆菌tet启动子的反义方向插到lacZa-肽编码区,因此可进行蓝/白斑筛选。正确定位于目标基因正义方向上游的T7转录和翻译信号使表达成为可能。与标准pET载体一样,通过转化λDE3溶原菌并用IPTG诱导或通过l CE6感染原始宿主菌生产目标蛋白。

优点

  •蓝 / 白斑筛选,便于克隆
  •高拷贝数,质粒DNA高产
  •以AccepTor TM载体或perfectly Blunt a 载体形式提供,便于快速PCR 克隆
  •目标基因无基础水平表达,消除了毒性基因产物相关的质粒不稳定性
  • 表达水平与经典pET载体相同
  • 用Tuner TM(DE3)pLacI宿主菌实现真正的表达水平“变阻器”控制。

PET系统:大肠杆菌中蛋白表达的金字招牌

   pET载体中,目标基因克隆到T7噬菌体强转录和翻译信号控制之下,并通过在宿主细胞提供T7 RNA聚合酶来诱导表达。Novagen的pET系统不断扩大,提供了用于表达的新技术和选择,目前共包括36种载体类型、15种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。

优点

  • 是原核蛋白表达引用最多的系统
  • 在任何大肠杆菌表达系统中,基础表达水平最低
  • 真正的调节表达水平的“变阻器”控制
  • 提供各种不同融合标签和表达系统配置
  • 可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌
  • 许多载体以LIC载体试剂盒提供,用于迅速定向克隆 PCR 产物
  • 许多宿主菌株以感受态细胞形式提供,可立即用于转化
  

  阳性pFORCE TM克隆系统具有高效克隆PCR产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。