原核表达载体包括大肠杆菌表达载体、枯草芽孢杆菌表达载体和链霉菌表达载体，其中大肠杆菌表达载体是应用得最广泛、发展得最为成熟的表达载体系统。随着分子生物学技术的快速发展，大肠杆菌表达系统不断得到快速发展和不断完善。与其他表达系统相比，大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，培养周期短，目的基因表达水平高，抗污染能力强。这些特点决定了大肠杆菌表达系统在基因和蛋白质表达技术中的重要地位。本文将以大肠杆菌表达系统来介绍一下原核表达系统的表达载体。

    大肠杆菌表达系统由宿主菌(即大肠杆菌)和表达载体构成。作为表达载体，首先必须满足克隆载体的基本要求，即具备复制能力、具有合适的酶切位点以及筛选标记，在这些基本骨架的基础上增加一些表达元件，能够将外源基因引人至大肠杆菌中。由于质粒适合于大:量制备和体外操作，因此，几乎所有的大肠杆菌表达系统都选用通过对天然质粒进行改造过的质粒作为运载外源基因的载体。这些作为表达载体的质粒大小一般在2~50kb范围内，在通常条件下不会在宿主菌间发生转移，整合到染色体上的概率也较低，在遗传上具有较好的稳定性和安全性。理想情况下，大肠杆菌表达载体具有以下特征:

• ①稳定的遗传复制能力，在无选择压力下能稳定地存在于大肠杆菌内;
• ②具有显性的筛选标记;
• ③启动子的转录水平是可以调控的，未激活时本底转录水平较低;
• ④启动子所转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程不会影响表达载体的复制;
• ⑤具备适用于外源基因插人的酶切位点。可以看出，复制子、筛选标志、启动子、终止子和核糖体结合位点是构成大肠杆菌表达载体的最基本元件。

1. GST标签载体

    来自GE Healthcare的谷胱甘肽转移酶(GST) 基因融合系统是一种表达、纯化和检测大肠杆菌中所产生的GST标签蛋白的多功能系统。系统包括三个主要成分: pGEX质粒表达载体、GST纯化的产品以及一系列GST检测产品。一系列切割GST标签的位点特异蛋白酶则是该系统的补充。GST亲和标签实现了温和的纯化过程，不会影响蛋白质的天然结构和功能。

    GST基因融合系统的优势包括:

• ①所有pGEX载体带有tac启动子，实现化学诱导的高水平表达;
• ②温和、非变性的缓冲液成分，以分离活性蛋白;
• ③基于Glutathione SepharoseTM填料的亲和色谱产品实现了从微克到克规模样品的一步纯化;
• ④方便的预装柱形式适合单个样品或平行筛选多个重组克隆;
• ⑤pGEX载体上的PreScission^TM蛋白酶、凝血酶或Xa因子识别位点能将目的蛋白从融合产物中切割下来;
• ⑥利用抗-GST抗体轻松检测融合蛋白。

    在天然情况下，GST以分子质量为26X10⁶Da的蛋白质的形式存在，它在大肠杆菌中的表达产物具有完全的酶活。经过鉴定，pGEX载体的重组日本血吸虫(Schistosoma ja-ponicum) GST的晶体结构与天然蛋白质一致。pGEX质粒载体将基因或基因片段与GST融合后，在细胞内高水平诱导表达。重组蛋白很容易利用Glutathione Sepharose填料通过亲和色谱从比如大肠杆菌细胞裂解液中纯化，要么是预装柱，要么是分批纯化。

    用位点特异的蛋白酶，可实现目的蛋白与GST的切割，此蛋白酶的识别位点位于pGEX载体上多克隆位点的上游。VGST标签的切除是在柱中进行的，作为纯化步骤或纯化后离心的一部分。重组蛋白可利用GST检测模块中提供的免疫分析来检测，或用抗-GST抗体在Western Blotting 中检测，或通过比色分析来检测。

    通过将一个基因或基因片段插人某个pGEX载体的多克隆位点，可构建出GST标签蛋白。载体提供了三种翻译读码框，从EcoR I限制性酶切位点开始。pGEX载体是为基因或基因片段的高水平细胞内诱导表达而设计的。大肠杆菌中的表达产生了标签蛋白，GST部分在氨基端，目的蛋白在羧基端。目前有13个pGEX载体;所有载体都有tac启动子，用于高水平的化学诱导表达，以及内部的laclq基因，在任何大肠杆菌宿主中使用。

    9个载体有扩展的多克隆位点(MCS)，含有6个限制性酶切位点。扩展的MCS有助于从多种市售λ载体的文库构建物中获得cDNA片段的定向克隆。pGEX-6P-1、 pGEX-6P-2和pGEX-6P-3都在GST结构域和多克隆位点之间编码了PreScission 蛋白酶的识别位点，用于位点特异的切割。pGEX-4T-1、pGEX-4T-2 和pGEX-4T-3都来自pGEX-2TK，含有凝血酶的识别位点。pGEX-5X-1、pGEX-5X-2 和pGEX-5X-3则是pGEX-3X的衍生物，含有Xa因子的识别位点。

    pGEX-2TK设计独特，它通过融合产物的体外直接标记，实现了表达蛋白的检测。此载体含有从心肌中获得的cAMP依赖蛋白激酶的催化亚基的识别位点。蛋白激酶位点位于GST结构域和MCS之间。利用蛋白激酶和[γ-³²P] ATP可直接标记表达的蛋白质，用标准的放射测定或放射自显影技术可轻松检测。pGEX-2TK是pGEX-2T衍生物，它的融合蛋白可用凝血酶来切割。pGEX载体都提供了三种翻译读码框，从EcoRI限制性酶切位点开始。

    为了补充pGEX载体，目前还有GST载体的测序引物，可立即用于pGEX载体中插人的双链DNA的测序。多种大肠杆菌宿主菌株可用于pGEX载体的克隆和表达。E. coliBL21，一种用于重组蛋白的最优表达的蛋白酶缺陷的冻干大肠杆菌宿主菌株，也可单独购买。

2. His 标签载体

    pET-28a-c (+)载体带有一个N端的His/Thrombin/T7蛋白标签，同时含有一个可以选择的C端His标签。pET28a载体的单一的多克隆位点请参考相应的环状质粒图谱。注意:载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。

    T7RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒粒子能够产生，并启动蛋白质表达，同时蛋白质表达将在T7终止子序列ARCat. No. 69337-3)的作用下终止蛋白质翻译。

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