大肠杆菌(E.coli)中RNA聚合酶的提取和纯化

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大肠杆菌(E.coli)中RNA聚合酶的提取和纯化

  对于RNA聚合酶以及其他众多的DNA结合蛋白,常使用亲和色谱技术来分离。利用此类蛋白质与DNA的特异性结合能力,可以将小段含有特定序列的DNA作为配基连接到支持基质上构成亲和色谱的介质。但是这样的配基在细胞外是很容易受到核酸酶的攻击而发生降解的,因此人们多数情况下并不选用核酸本身作为配基,而是选择-些具有类似生物学特性的其他亲和配基,例如肝素,由于该分子既有亲和力,又带电荷,能与蛋白质发生离子作用,因此是用亲和色谱法分离DNA结合蛋白的理想配基。这里介绍采用亲和、凝胶过滤和离子交换三步色谱的方法从大肠杆菌培养液中分离RNA聚合酶。

  将E.coli 培养液离心后收获细胞,向其中加人两倍体积的裂解缓冲液[20mmol/L Tris-HCl, pH=8,含5% (体积分数)甘油、1mmol/L EDTA、0.25mol/L NaCl、20mmol/L 2-巯基乙醇、lmmol/L Pefabloc]使之悬浮,在冰浴中进行超声破碎,然后于5℃、12100g 离心1h,弃去沉淀得到上清液作为原料。向上清液中添加硫酸铵至终浓度为50%饱和度,于冰浴中搅拌30min使RNA聚合酶充分沉淀,于5℃、12100g离心90min,弃上清,将沉淀溶解于起始缓冲液[20mmol/L Tris-HCl, pH=8,含5%(体积分数)甘油、0.1mmol/L EDTA、10mmol/L 2-巯基乙醇、0.1mmol/L Pefabloc、0.2mol/L NaCl],并利用PD-10凝胶柱进行缓冲液交换。样品用0.45um滤膜过滤后进行亲和色谱,色谱柱为HiTrapHeparin 5ml,取35ml样品上样,并用起始缓冲液洗涤色谱柱,流速为1ml/min(30cm/h),洗去穿透峰后进行洗脱,极限缓冲液为20mmol/LTris-HCl,pH=8,含5%(体积分数)甘油、0.1mmol/L EDTA、10mmol/L2-巯基乙醇、0.1mmol/L Pefabloc、1.0mol/L NaCl。采用NaCl 浓度线图 11.13 HiTrap Heparin 5ml亲和色谱图性梯度洗脱,斜率为20个柱体积内NaCl浓度从0.2mol/L增至1.0mol/L。分部收集,结果见图1。

E.coli中RNA聚合酶的提取和纯化

  上步收集得到的活性分部经浓缩后进行凝胶过滤色谱,采用的色谱柱是Superdex 200 HR10/30。取0.5ml样品上样,洗脱缓冲液为20mmol/L Tris-HCl, pH=8,含5%(体积分数)甘油、0.1mmol/L EDTA、10mmol/L 2-巯基乙醇、0.1mmol/L Pefabloc、0.2mol/L NaCl, 流速为0.25ml/min (19cm/h),得到结果如图2所示。

E.coli中RNA聚合酶的提取和纯化

   凝胶过滤分离的同时也实现了缓冲液交换,将上步收集得到的样品直接进行离子交换色谱。色谱柱选用HiTrap Q 1ml,加样量为1ml,加样后用起始缓冲液洗涤,流速为1ml/min (158cm/h)。 起始缓冲液和极限缓冲液的成分均与亲和色谱时相同。采用NaCl浓度线性梯度洗脱,斜率为30个柱体积内NaCl浓度从0.2mol/L增至0.5mol/L,分部收集,每分部为0. 5ml,所得结果如图3所示。纯化后的样品经SDS-PAGE分析纯度为90%。