蛋白质双向电泳样品的准备

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本文单独介绍蛋白质双向电泳中样品如何准备,之所以要单独介绍,是因为这是整个双向电泳实验的最关键的一环,同时样品的制备没有统一标准,这在一定程度上加大了实验的难度。但是尽管如此,以下5点原则是公认的。

1.样品制备基本原则

(1)保证所有待分析的蛋白样品处于溶解状态(包括多数疏水性蛋白),且制备的方法可重现。
(2)样品在聚焦时要防止蛋白聚集沉淀的发生。
(3)防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰(如酶性或化学性降解等)。
(4)样品中的核酸和某些干扰蛋白要完全去除。
(5)尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白,从而保证待研究蛋白的可检测性。 基于这些原则,样品制备需要3种主要的试剂:

(1)离液剂(Chaotropes),主要包括尿素(Urea)和硫脲(Thiourea)。 (2)表面活性剂(Sufactants),也称去垢剂,早期常使用NP-40、TritonX-100等非离子去垢剂,近几年较多地改用如CHAPS与Zwittergent系列等双性离子去垢剂。 (3)还原剂(Reducing Agents),最常用的是二硫苏糖醇(DTT),也有用二硫赤藓糖醇(DTE)以及磷酸三丁酯(TBP)等。当然,也可以选择性地加入Tris-base,蛋白酶抑制剂(如 EDTA、PMSF or Protease Inhibitor of Cocktails )以及核酸酶。

  样品的来源不同,其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合,以达到对样品蛋白的最大抽提。

2.样品准备

(1)培养细胞(Culture Cell)样品处理方法。 延伸阅读:《细胞培养

1)材料与试剂。
a.培养的目的细胞。
b.裂解缓冲液有多种配方,常见的如下:

常见的裂解缓冲液
Lysis Buffer 配方 用途
A 40 mmol/L Tris-base (pH 9.5) in Ultrapure H20 适于提取水溶性蛋白
B 8 mol/L Urea, 4% CHAPS, 40 mmol/L Tris-base, 40 mL 此为经典配方
c 5 mol/L Urea, 2 mol/L Thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1 % (W/V) DTT, 0.5% CA 适于提取膜蛋白
D 100 μL SDS Sample Solution [ 1% ( W/V) SDS, 0.375mol/L Tris • HCl, pH 8. 8, 50 mmol/L DTT. 25% ( V/V) Glycerol ] 适于提取难溶的沉淀蛋白

注意:CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前均需要加入。

C.广谱蛋白酶抑制剂混合物成分。
PMSF 35 μg/mL or 1 mmol/L
EDTA 0. 3 mg/mL (1 mmol/L)
抑肽素0.7 μg /mL
蛋白酶抑制剂混合物
亮肽素0.5 μg /mL

d.PBS等其他试剂。

2)方法与步骤。
此为总蛋白提取方法:
a.培养细胞的收集;
b.用磷酸缓冲液(PBS)洗细胞3次(室温,1 000 g,各2 min);
c.将细胞分装到1.5mL Eppend〇rf管中,吸干残留的PBS;
d.加入裂解缓冲液(1.5xl06个细胞大约加入100μL裂解液),在室温振荡lh,使其充分溶解;
e.4℃ 40 000 g,离心 1 h;
f.吸取上清并用Brandford法定量蛋白,然后分装至Eppendorf管里保存在-80℃备用。

(2)组织样品处理方法。

大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质的程序依旧不通用。但遵循的原则基本相同,下面介绍提取植物树叶总蛋白的方法-三氯醋酸-丙酮沉淀法

1)材料与试剂。
植物树叶,
提取液:含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮
裂解液:2.7g尿素、0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5mL)使用前再加入1mol/L的DTT 65μL/mL.

常见的蛋白酶抑制剂
蛋白酶抑制剂 可有效抑制的酶 缺点
PMSF
很常用的抑制剂,使用浓度为1mmol/L
PMSF是不可逆抑制剂, 能抑制丝氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶 PMSF在含水溶液中很快失活,需在使用前现配
PMSF在含有巯基试剂(DTT或2-巯基乙醇)时效果不好。这种缺点可以通过将样品在含有PMSF而无巯基去污剂的溶液中克服,含巯基去污剂可以在其后加入
PMSF毒性相当大
AEBSF
丝氨酸抑制剂,使用浓度为4 mmol/L
AEBSF在抑制活性上与 PMSF相近,但它更易溶于水而且毒性低 AEBSF具有修饰能力,会改变蛋白的pI值
1 mmol/L EDTA,1 mmol/L EGTA
这些通常在1mmol/L浓度使用
通过鳌合蛋白酶维持活性所必需的金属离子,这些混合物能抑制金属蛋白酶 -
多肽水解蛋白酶抑制剂
(如Leupeptin,Pepstatin,Aprotinin和Bestatin)
这些抑制剂属于不可逆抑制剂,在有DTT存在下作用
使用浓度为2-20μg/mL
亮肽素(Leupeptin)能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶
抑肽素(Pepstatin)抑制天冬氨酸蛋白酶
抑肽酶(Aprotinin)能抑制许多丝氨酸蛋白酶
苯丁抑制剂(Bestatin)能抑制氨基酸多肽酶
多肽蛋白酶抑制剂价格昂贵
多肽蛋白酶抑制剂是小分子多肽,因此有可能在双向电泳结果中出现,根据其分子大小范围被第二向凝胶分离
抑肽素(Pepstatin)在pH为9时不能起抑制作用
TLCK, TPCK
(对甲苯磺酰基赖氨酸氯甲基酮,苯磺酰基赖氨酸氯甲基酮)
使用浓度0.1-0.5mmol/L
这两种相近的化合物不可逆地抑制丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶 -
苄脒(Benzamidine)
使用浓度1-3mmol/L
Benzamidine抑制丝氨酸蛋白酶 -

2)操作步骤。
a.在液氮中研磨叶片。
b.加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃ 8000 rpm以上 1h)弃上清。
c.加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇),摇匀后离心(4℃ 8000 rpm 以上1h),然后真空干燥沉淀,备用。
d.上样前加入裂解液,室温放置30min,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心 (4℃ 8000 rpm以上1h或更长时间以没有沉淀为标准)。
e.用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入-80℃备用。

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