水稻常用分子标记检测

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服务概述

实验原理

分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记,是DNA水平遗传多态性的直接反映。

简单序列重复,又称微卫星序列,其串联重复的核心序列为1-6bp,重复单位数目一般10-60个,其多态性主要来源于串联基序数目的不同。其原理是根据串联重复序列设计引物,通过PCR反应扩增出不同长度的PCR产物,将扩增产物进行凝胶电泳,根据分离片段的大小决定基因型。

插入缺失(Insertion-Deletion ,InDel),指不同品种(系)在基因组中有小片段的核苷酸序列的插入或缺失,其原理是根据插入缺失位点设计引物,通过PCR反应扩增出不同长度的PCR产物,将扩增产物进行凝胶电泳,根据分离片段的大小决定基因型。

核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP),指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异。其原理是根据多态性位点设计引物,通过PCR反应扩增出目标片段,利用测序来确定核苷酸差异。

实验目的

利用分子标记可以进行品种的基因型分析,真假杂种鉴定,遗传连锁图谱构建,分子标记辅助选择育种,基因定位、克隆,物种亲缘关系鉴别。

实验试剂

实验试剂
PCR试剂 测序试剂
10 × PCR Buffer (mg2+ Plus)(R10T1,TaKaRa) EXOI (M0293L, Biolabs)
rTaq(R10T1,TaKaRa) SAP (D2660A, TaKaRa)
dNTPs Mix(Pharmcia分装) BigDye (4336913, ABI)
d2H2O 5 X Bufer (4336699, ABI)
甲酰胺(4311320,ABI)
琼脂糖胶电泳试剂
琼脂糖Agarose (G-10, BIOWEST) 核酸染料GoldView (Amresco 分装)
DNAMarker (DL2000 Plus, BM111,TransGen) 0.5xTBE溶液
聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)胶电泳试剂
丙烯酰胺(Acrylamatide, AB1032, Ultra pure, BIO BASIC INC) 过硫酸铵AP (Ammonium persulfate, A3678, Sigma)
甲叉-丙烯酰胺( Bis- Acrylamatide, BB0025, Ultra pure, BIO BASIC INC) 去离子甲酰胺(deionized formamid, F0606,生工生物)
NaOH ( 分析纯,光复) 溴酚蓝(Bromophonel blue, B0126,Sigma)
二甲苯氰(Xylene cyanol FF, X4126,Sigma) 硅化剂(Plusone Repel Silane, 17-1332-01, Amersham. Biosciences)
反硅化剂(Plusone Bind silane, 17-1330-01, Amersham. Biosciences) TEMED (T9281, Sigma)
95%乙醇(10009134, 分析纯,沪试) 硝酸银(10018461,分析纯,国药化试)
甲醛(83012,分析纯,湖北奥生新材料科技有限公司) Tis粉(Tis Amino, 7861-- Angus Chemical Company)
硼酸(10004818,分析纯,国药化试) EDTA (10009717,分析纯,沪试)
尿素(10023218,分析纯,国药化试) 1×TBE溶液
部分试剂配方
40%的丙烯酰胺胶母液配制 过硫酸胺(AP)的配制
丙烯酰胺380g
甲叉一丙烯酰胺20g
加60℃左右的d2H2O定容至1000ml,迅速搅拌至澄清透明。过滤后4℃保存。
终浓度10%,用分析天平称取4gAP粉末,加纯水40 ml,摇匀溶解,4C保存(不要超过2个星期,最好新鲜配制)。
上样用指示剂(10 x loading buffer)配制 5xTBE的配制
甲酰胺(deionized formamid) 500ml Tris粉 54 g
4 N NaOH 1.32 ml 硼酸(Boric acid) 27.5g
溴酚蓝( Bromophonel blue) 263mg 0.5M EDTA (PH7.9)
二甲苯氰(Xylene cyanol FF) 263mg 加d2H2O至 1000ml
d2H2O 25ml 搅匀后室温保存,0.5和1xTBE溶液用此分别稀释10倍和5倍后用。
混匀后放在摇床上摇12小时,4℃保存。
4%的PAGE胺胶液配制          制一板胶用量     配制40版用量
5xTBE溶液     15ml     600ml
尿素     36.04g     1441.6g
d2H2O      22ml     880ml
实际配置时每次配制40板用量,搅拌过夜后过滤,滤液4℃保存。

实验仪器

PCR仪(ABI9700)

电泳仪(MODEL 250EX, LIFE TECHNOLOGIES)

水平电泳槽(北京六一)

垂直电泳槽(北京六一)

通风橱(2004-SFH, SUNLAB)

凝胶成像系统

测序仪(ABI 3730)

操作步骤

1.PCR 反应

1.1调整模板浓度至~50 ng/ul;

1.2按下列体系配制反应混合液,混匀,加20ul矿物油,离心5秒

Template DNA 2 ul
10x PCR buffer 2.0 ul
dNTPs Mix (2 mM) 1.6 ul
Primer F (10 pM) 0.3 ul
Primer R (10 pM) 0.3 ul
rTaq (5 U/ul) 0.1 ul
Add d2H2O to 20 ul


1.3 PCR反应程序

94℃ 4 min 1 cycle
94℃ 30 sec 55℃ 30 sec 72℃ 30sec 35 cycles
72℃ 5 min 1 cycle
4℃ 1 min
以上退火温度可以根据不同引物适当调整。

1.4检测:加~2 ul 10xLoading buffer,短暂离心;

2.琼脂糖凝胶电泳(适合InDel 标记和多态性片段较大的SSR标记)

2.1用琼脂糖胶将洗净、干燥的制胶板的两端封好,水平放置在工作台上:调整好梳子的高度;

2.2称取1.2 g琼脂糖于120 ml 0.5xTBE中,在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解,冷却至50°C左右时加入5ul GoldView混匀,倒入制胶板中;

2.3凝胶凝固后(~30min),小心拔去梳子,加入2ul Loadingbuffer至扩增产物中,混匀,取8ul样品依次点入加样孔中,最后一-孔点入5ul DNA Marker;

2.4将制胶板小心放入电泳槽中,打开电泳仪电源,使核酸样品向正极泳动,250V电泳20-30min (根据多态性大小调整);

2.5电泳完成后,切断电源,取出凝胶,清水中短暂漂洗,用保鲜膜包好置于凝胶成像系统中观察照相,读取基因型。

3.PAGE胶电泳(适合-般SSR标记和多态性较小的InDel标记)

3.1.胶板的制备

(1)将玻璃底板和盖板洗净晾干待用:

(2)用5cm见方的滤纸片沾上95%乙醇擦拭底板和盖板3-5遍至玻璃板洁净无污渍,待用:

(3)在通风橱中取1 ml 95%乙醇至1.5 ml离心管,加入2 ul反硅化剂,于涡旋震荡器上混匀,均匀倒在用(2)中95%乙醇擦拭过的底板上,用滤纸片来回擦拭,至无明显液体痕迹,再加入3-5 ml 95%乙醇用一张新的滤纸来回擦拭,以保证反硅化剂在底板上均匀分布;

(4)在通风橱中用胶头滴管吸1 ml硅化剂至用95%乙醇擦拭过的盖板,用滤纸片来回擦拭,至无明显液体痕迹,再加入3-5 ml 95%乙醇用一张新的滤纸来回擦拭,以保证硅化剂在底板上均匀分布:

(5)将底板水平放置(擦过反硅化剂-面朝上),在两侧放好压条( spacer),将盖板(擦过硅化剂-面朝下)重合在底板上,两边各用两个夹子夹紧;

(6)配制胶液:取60 ml 4% PAGE胶液至烧杯中加入500 μl AP液和50 μlTEMED,用玻璃棒迅速搅勾,往底板和盖板之间的缝隊灌胶,待胶液充满整个玻璃板,插入梳子。胶板制备完后需放置至少1个小时才可用。

3.2. 电泳

将制好的胶板置于水槽中洗去板面上的碎胶,轻轻拔出梳子(注意不要弄破胶面),用水冲去碎胶,将盖板面朝向电泳槽放入电泳槽中,两边各夹3个夹子,扭紧下部螺丝,加入1xTBE溶液覆盖胶孔,电泳仪设置:电压: 2000V, 电流:200mA,功率: 90W, 预热40分钟后插入梳子点样3-5ul。

3.3. 显影

(1)硝酸银溶液配制:称取2 g硝酸银于试剂瓶中,加入2000 ml蒸馏水,溶解,倒入塑料盆中,盖上盖子避光;

(2) NaOH溶液配制:称取40 g NaOH于试剂瓶中,加入2000 ml蒸馏水溶解,加入2瓶盖甲醛溶液,混匀倒入另-一个塑料盆中,盖上盖子,置于通风橱中;(3)取下电泳完毕的胶板,撬开盖板,将底板在蒸馏水中漂洗一 遍后置入硝酸银溶液中浸泡10分钟,然后取出在蒸馏水中漂洗一遍,再置入含甲醛的NaOH溶液中,至带型清晰显出时捞出,放于清水中漂洗4-5遍,捞出平放至胶面干燥,即可读带。

4.SNP标记检测

4.1. PCR扩增

参照前面一般PCR扩增。

4.2. PCR产物检测

制备琼脂糖胶(1%),检测PCR扩增产物。特异性扩增带与预期大小相符,亮度(浓度)与Marker (DL 2000, ~50 ng/uI)相仿即可。

4.3. PCR产物消化处理

PCR产物 5ul  
10×SAP Buffer 0.3ul ①37℃水浴1h
25mM MgcL2 0.18ul ②80%水浴20min灭活
Exol(20U/ul) 0.25ul ③1Kb左右的片段取3ul作DNA测序
模板
SAP(2U/ul) 0.13ul 注:取PCR产物尽量避免取到上层矿物
Add d2H2O to 8ul


4.4. 测序反应

DNA模板 3ul 反应程序
Primer(单引物) 0.16ul 93℃ 3min
5×buffer 1.75ul 96℃ 10sec,50℃ 10sec,60℃ 4min,33-35Cycles
BigDye 0.5ul 25℃ 10min
Add d2H2O to 10ul  

4.5. 测序产物的纯化

(1)1ml95%乙醇中加入40ul 3 M NaAC,混匀后按26ul/孔分装进测序样品,混匀,放置15min,3000g,离心30min,弃上清;

(2)分装75%乙醇,75ul/孔,3000g,离心30min;

(3)弃上清,于超净工作台吹干,约5 min;

(4)分装甲酰胺,7 ul/孔,94℃变性(~5 min),置于冰上冷却。

4.6.上机(ABI3730测序仪)测序 按测序仪操作说明进行。

注意事项

1. 做PAGE胶时:待盖板和底板擦干净完毕后,在倒胶之前,需用梳子插入两玻璃板之间,检查玻璃板之间空隙是否均匀;若梳子不能顺利插入空隙,务必调整盖板和底板组合,以免倒胶时胶的厚度不均匀或者是梳子插不进去的情况出现。

2. PCR扩增时:选择SSR引物进行PCR扩增时,引物的退火温度和PCR产物大小,以便以后点样。

3. 点样时:为了确定点样时间和样品点样间隔,应首先用两亲本进行PCR扩增,然后就可以根据PCR产物大小和SSR引物在两亲本之间多态性大小,确定点样顺序和时间间隔。当PCR产物有拖带时也可以在点样之间将PCR产物用96℃ 3min进行变性,这样效果会好一些。

4. 显影时:当用甲醛显影时,不能在显影液中放时间太久,不然容易脱胶;待显影完毕后,可以在水中多漂洗数次,可以去除甲醛的气味同时还可以避免胶被氧化风干。


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