实验目的:

亚细胞定位，BiFC 等需要进行瞬时表达的实验。

实验材料准备:

将中花11种子按照照组培方法于生根培养基中发芽，28℃暗培养10-15天。少于10天的黄化苗叶鞘很短，细胞太小，不利于观察:而大于15天的黄化黄叶鞘由白色转为略带褐色，细胞太老，原生质体转化后活细胞很少。

试剂和仪器
A. CsCI梯度离心纯化的质粒，或者QIAGEN plasmid Midi Kit (Cat no.12143)纯化的质粒。
B.配制以下母液: 2 M Mannitol (Sigma, FW: 182.17): 36.434 g加ddH2O定容至100 ml,微波加热溶解; 0.2 M KCI (Sangon, FW: 74.55): 1.491 g加ddH2O定容至100 ml; 1 M CaCl2 (BBI, FW: 147.02): 14.7 g加ddH2O定容至100 ml; 0.5 M MgC2 (Sigma, FW: 95.21): 4.76 g加ddH2O定容至100 ml; 1.54 M NaCI (BBI, FW: 58.44): 8.99 g加ddH2O定容至100 ml; 0.1 M MES KOH, pH5.7; MES hyrale (Sigma, FW: 195.24): 19 524 9加ddH2O定容至100 ml, KOH调至pH5.7
C.其他试剂和仪器: Cllulose RS (Yakult Horonsha), Macerozyme (Yakult Honsha), PEG4000(Fluka)，BSA(Sigma); 可得加此注度的吊篮式冷海离心机，2m圆底离心管，10ml图度高心管，所有与原生质体接触的枪头都要剪去少尖头。

实验步骤：

1)配制酶解液，现配现用:
Enzyme solution 0.6M Mannitol 10 mM MES (pH5.7) CelluloseRS (1.5%) Macerozyme (0.75%)	10 ml所需母液 3ml 2M Mannitol 1 ml 0.1M MES 0.15 g 0.075g
搅拌溶解，55℃加热 10min,自然冷却，再加入以下试剂:
0.1%BSA 1 mM CaCl2 ddH2O	0.01g 10μl 1 M CaCl2 6 ml
同时准备0.6M Mannitol;
2)将酶解液倒到大小合适干净的培养血中。将暗培养10-15天的黄化苗攻出，将叶鞘浸在0.6 MMannitol中，用锋利的刀片快速切割叶鞘成1 mm以下的小段，越细越好，不要撕扯。切下的叶鞘立即转入配好的酶解液中。一般50棵黄化苗的叶鞘用10ml 酶解液酶解，可至少转化5个质粒组合。更多的转化可扩大相应反应体系。叶鞘切完毕，泡在酶解液中，抽真空5-10min,使大部分叶鞘下沉到酶解液底部。将酶解液用锡纸包被以避光，放置在28℃，40-50 rpm的摇床上，酶解4-5hrs.酶解完成后，取一滴酶解液镜检， 如果细胞圆而发亮，则健康，继续往下做:如果细胞扁且发黑，则弃去。
酶解将近完成时，配制以下溶液:
W5 solution 154 mM NaCI 125 mM CaCl2 5 mM KCI 2 mM MES (pH5.7)	100ml所需母液 10 ml (1.54 M NaCI) 12.5 ml (1M.CaCl2) 2.5ml 0.2M KCI 2 ml0.1M MES(pH5.7)
用ddH20定容至100 ml.
MMG solution 0.6 M Mannitol 15 mM MgCI22 4 mM MES (pH5.7)	100ml所需母液 30 ml 2 M Mannitol 3ml 0.5 M MgCl2 4ml 0.1 M MES(pH5.7)
用ddH20定容至100 ml.
W5和MMG只要没有长菌，就可以继续使用。
3) 将酶解液混勾，用150目的筛子过滤到新的培养血中，再转移至10m图底离心管中。100 g转速，加速、减速加速度为2，离心10 min,并预冷MMG溶液。
4) 用1ml枪吸走上清，可见到管底有较多黄绿色沉淀，此为健康的细胞:果沉淀很少，或者沉淀很白，则细胞质量不好。缓缓加入4mlW5溶液，轻轻混匀，再以100g转速，加速、减速加速度为2，离心10 min.
5) 用1ml枪吸走上清，缓缓加入4 ml预冷的MMG溶液，以4℃, 100g转速，加速、减速加速度为2,离心10 min.
6)用1 mI枪吸走上清，缓缓加入2 ml预冷的MMG溶液，轻混匀，以4℃,100g转速，加速、减速加速度为2，离心10 min。计算需要原生质体的体积: 200μlxN, 再多留500 μl。 用枪吸走上清，用所需体积的MMG溶液混匀原生质体，冰浴30 min。
7)在冰浴期间准 备:将需要转化的质粒稀释成20 ul,质粒的量为2-10μg,加到2ml圆底离心管中。将离心机转头换成2 ml的小转头，温度设定为室温。
配制40% PEG 4000溶液:
40% PEG 40% PEG4000 0.6 M Mannitol 100 mM CaCl2	5 ml所需母液 2g 1.5 m|x2 M Mannitol 0.5 mlx1 M CaCl2
加ddH2O至5ml。
PEG需要用微波炉稍微加热溶解，混匀，在转化前放在37°C温箱中保温，防止其再次凝固。
8)将原生质体混匀，依次向2ml离心管中(已加入了20μl质粒)加入200原生质体和220 ul 40% PEG4000溶液，立即轻柔上下颠倒混匀并计时。室温放置20 min。
9)向2ml离心管中加入1mIW5溶液，混匀，室温100g转速，加速、减速加速度为2，离心10min。用1 ml枪小心吸走上清，再加1.5 ml W5, 28°C暗培养12-16hrs (不要短于8 hrs或者超过24 hrs)。
10)观察前，以室温，100g转速， 加速、减速加速度为2,离心10 min.吸走上部液体，仅留底部200μl细胞。轻轻混匀，在Confocal下观察荧光。

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