酵母双杂交案例分析(文库构建到文库筛选)

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酵母双杂交文库构建服务案例(限于篇幅,我们只选取了实验报告中部分步骤,如果需要了解更多的实验信息,请联系技术支持人员)

一、 试剂、耗材(略)
二、仪器设备(略)
三、试剂及配制 (略)
四、酵母双杂交文库构建实验流程

1、 Trizol法RNA的提取RNA电泳图如下:`
2、使用Oligotex mRNA Kits(Qiagen)分离纯化样本的mRNA,mRNA质量可以满足文库要求,mRNA总量为6.9 ug,电泳检测图片如下
3、 酵母双杂交文库构建
3.1第一链cDNA合成
3.2 cDNA第二链的合成
3.3 加5’接头(3个读码框,每个读码框连接一份,共3份)
3.4 cDNA长度分离, 使用低熔点琼脂糖电泳cDNA,切胶回收1 Kbp以上的条带,乙醇沉淀后溶于14 μL水中。
3.5 使用Infusion重组反应体系连接cDNA与载体pGADT7
3.6 电转化大肠杆菌感受态细胞
4、 酵母双杂交文库的构建质量鉴定
4.1 库容量的鉴定
取转化后细菌原液10 uL稀释100倍后,从中取出10 uL涂布LB平板(含氨苄抗性),第二天计数。
CFU/mL=平板上的克隆数/10 uL×100倍×1×103 uL
文库总CFU= CFU/mL×文库菌液总体积(mL)
4.2 插入片段大小鉴定
从转化平板上随机挑取24个单克隆菌落,经PCR扩增后,用电泳检测PCR产物大小。 结果如下图所示:

酵母双杂文库构建

五、 文库扩增及质粒提取
将转化后原始文库菌液涂布氨苄抗性培养基平板扩增培养,第二天用液体培养基从平板上洗脱菌苔,取其中2/3体积用Qiagen大抽试剂盒抽提质粒DNA,剩余1/3体积中加入25%无菌甘油混合均匀后灌装保种管,冻存于-80℃冰箱。
六、文库菌保存和文库筛选
冻存于-80℃冰箱内,可以保存2年以上,文库质粒可以直接用于酵母文库筛选,pGADT7 酵母双杂交文库菌的抗性为氨苄抗性(50 ug/mL)

备注:
1. 文库构建使用的引物序列, 双杂交文库扩增检测引物:
F:5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGAGCGCCGCCATG-3′
R:5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′
如果需要对文库中的克隆质粒进行测序,请使用以下引物:
T7:TAATACGACTCACTATAGGGC
ADR:GTGAACTTGCGGGGTTTTTC

酵母双杂交文库筛选ORF1的相互作用蛋白服务案例

一、试剂、耗材(略)仪器设备(略)试剂及配制 (略)
二、诱饵载体构建pGBKT7- ORF1的构建与鉴定(此步骤为常规的实验方法,可以通过酶切、测序等方法鉴定酵母杂交诱饵载体正确性,此处略)
三、ORF1自激活检测

3.1酵母转化反应
将各种质粒转入受体菌AH109中,观察检测结果。

Reaction AD plasmid BD plasmid 涂板种类 备注
1 pGADT7-largeT pGBKT7-p53 SD-TL 阳性对照
2 pGADT7-largeT pGBKT7-laminC SD-TL 阴性对照
3 pGADT7 pGBKT7-ORF1 SD-TL 自激活检测
4 - pGBKT7-ORF1 SD-T 筛库备用

3.2 酵母转化方法
1.从YPDA平板挑取AH109单菌落接种于YPDA液体培养基4 ml,30℃,225 rpm,振荡培养18-20 h(过夜),至OD600>1.5,一般为4左右。
2.转接YPDA液体培养基,培养体积为50 ml,使初始OD600=0.2,30℃,225 rpm,振荡培养4-5h,至OD600=0.6。
3.离心收菌,室温,4000 rpm,5 min。
4.用20 ml无菌水重悬菌体,混匀,离心收菌,室温,4000 rpm,5 min,弃上清。
5.用5 ml 0.1 M LiAc重悬菌体,混匀,离心收菌,室温,4000 rpm,5 min,弃上清。
6.用500 ul 0.1 M LiAc重悬菌体,混匀,分装至1.5 ml离心管,每个50 ul(每个转化),备用。
7.每个1.5 ml离心管中依次加入相应试剂,用枪头吹打混匀,或剧烈振荡1 min左右,至完全混匀。
8. 30℃水浴孵育,30 min。
9. 42℃水浴热激,25 min。
10. 30℃水浴复苏,30 min。
11.离心收菌,室温,4000 rpm,5 min,弃上清。
12.每个转化用200 ul无菌水悬浮菌体,尽量温和地混匀,涂布相应的缺陷型筛选平板。
13. 30℃恒温培养4天。
3.3 ORF1自激活检测结果
pGBKT7-ORF1 + pGADT7共转化AH109长出的酵母转化子随机挑取了6个菌落进行自激活检测。包括HIS3、ADE2和LacZ共3个报告基因的检测。
HIS3和ADE2的检测采用点板培养的方法,将转化子点板至SD-TLHA平板,30℃恒温培养4天,观察其生长状态。
LacZ报告基因的检测方法如下:
1. 从转化平板随机挑取6个菌落于滤纸片上。
2. 将滤纸完全浸于液氮中90 s,取出常温放置2 min晾干。
3. 在培养皿中加入新鲜配制的显色液,一般9 cm培养皿用2-3 ml显色液。
4. 将显色液加入培养皿中,再放入一张干净的滤纸,让其完全浸湿,将冻溶后的滤纸放在最上面,使显色液浸透表层,盖上皿盖。30℃避光培养,20 min后开始观察,一般2 h后可开始看到颜色变化。4-5h拍照记录结果。

酵母双杂交自激活检测

对照菌株在SD-TL缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在SD-TLHA缺陷平板生长。pGBKT7-ORF1 +pGADT7转化子中随机挑选的6个菌落在SD-TLHA缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,LacZ检测中结果也与阴性对照相同,因此不存在自激活。

自激活检测结论:ORF1诱饵克隆没有自激活作用。

四、文库筛选
用含有正确pGBKT7-ORF1诱饵质粒的AH109酵母转化子作为受体菌制备感受态,将文库质粒pGADT7-酵母双杂-cDNA转入其中,涂SD-Trp-Leu-His+ 5 mM 3AT平板。

酵母双杂交文库转化效率检测

五、影印清除
为了消除背景生长菌落的干扰,在培养到第3天时,用绒布对筛库平板进行影印清除后,继续培养7-14天。分批挑取再次长出的转化子菌落进行下一步检测。
六、阳性克隆鉴定
至影印清除后继续培养7-14天,从筛库平板中挑取长出的阳性克隆单菌落,共挑取到20个初始阳性克隆转化子转接到SD-TL缺陷型平板中继续培养2-3天。
6.1 阳性克隆His和Ade报告基因的检测
将上述SD-TL缺陷型平板上长出的20个初始阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点种至SD-TL和SD-TLHA缺陷平板,30℃恒温培养3-4天,结果如下图所示:

酵母双杂交报告基因检测

阳性克隆检测结果显示:在20个初始阳性克隆中,有13个能在SD-TLHA生长的是激活了ADE2和HIS3报告基因。

6.2 阳性克隆LacZ报告基因检测
将20个初始阳性克隆用无菌水重悬后点于滤纸片上进行LacZ报告基因检测。结果如下图所示:

酵母双杂交阳性克隆LacZ报告基因检测 七、酵母阳性克隆DNA提取和测序比对
通过测序比对,可以将重复的阳性给克隆子去除,本实验案例中,有多个克隆子为重复的阳性克隆,经过筛除后,我们可以确认获得了6个完全不同的阳性克隆子。

八、回转验证
用含有正确pGBKT7-ORF1诱饵质粒的AH109酵母转化子作为受体菌制备感受态,将6种阳性克隆质粒DNA分别转化其中,分别回转验证His和Ade报告基因的检测和LacZ报告基因检测。

酵母双杂交回转验证

实验结论:

本项目以ORF1基因cDNA克隆为诱饵,筛选cDNA酵母双杂交文库,在筛选到的20个初始阳性中,经过鉴定结果显示有13个能激活ADE2、HIS3和LacZ报告基因。经过对这些阳性克隆质粒进行DNA测序和BLAST比对分析,结果表明它们分别属于6种不同蛋白的编码基因。 通过对这6种阳性克隆的回转验证检测,结果显示所有阳性克隆都能通过对ADE2、HIS3和LacZ报告基因的回转验证。