为什么毕赤酵母蛋白不表达?

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为什么毕赤酵母蛋白不表达?

重组酵母PCR 检测证明目的基因重组,却在诱导之后,在表达上清中检测不到目的蛋白,我们整理得出以下方法,仅供参考。

毕赤酵母

  表达上清中检测不到目的蛋白,可能因为蛋白表达量低,而没有检测到。如果蛋白浓缩N倍之后仍然检测不到,可能因为蛋白没有分泌出来,可通过裂解酵母来检测胞内蛋白,具体的方法查阅相关文献。
  诱导过程是否合理。包括诱导体系、甲醇浓度(一般在0.5%-1.0%)、转速等。如果诱导的过程也没有问题,可先检测mRNA有没有转录。如果证明已转录,实验仍不成功,建议替换酵母株,重新实验。

操作提示:

·pH:
根据实验手册进行,或适度提高。一般 BMMY的pH7.0-7.5比较合适。
·温度:
28℃或室温下。
·污染:
瓶口盖纱布的基础上加盖报纸。
·菌株:
选择合适的菌株(若用GS115表达不出蛋白,可换KM71H)。
·偏爱密码子:
酵母对分子量大(30KD以上),结构复杂(如一些蛋白酶),二硫键含量多的蛋白往往不能有效表达,尤其是分泌表达。密码子改造对一些较小的而且结构简单的蛋白表达量的提高可能有一些作用。
·糖基化:
胞外表达,存在糖基化的问题。但是酵母分泌表达的N糖基化是可以预测的,有如下序列:X为任意氨基酸,NXS/T就是潜在的糖基化位点,1个糖基化位点会加上1-3KD左右的糖基。
·表达时间与空质粒转化对照:
诱导时间越长杂分泌的蛋白就越多,且分子量都比较大。因此最好做一个空质粒转化的对照,以确定是不是自身的蛋白分泌的结果。
·表达量:
30KD,10mg/L表达量已经很高,最直接的方法是发酵,一般提高5-10倍。大肠杆菌一样出现大团的超表达蛋白。
·表型与表达:
重组SalI和BglII酶切产生单交换和双交换,结果就是产生Mut+和Muts表型的菌株;前者在甲醇诱导表达时生长快,消耗的甲醇多,后者生长慢,消耗的甲醇少,所以诱导表达时Muts表型要求更高的菌体浓度。一般用Mut+表型的较多,但是对某些蛋白Muts菌株可能表达的更好。

培养基要求:

YPD——最基本的培养
BMGY(灭菌,可用YPG代替,不可用YEPD代替)——诱导表达前培养
BMMY(灭菌)——诱导表达
MD——电转化后筛选his+