western blot检测技术

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western blot检测技术

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蛋白质免疫印迹技术(Western blot)是由1981年尼尔伯奈特命名的,是用来判断蛋白质表达方试的一门技术,实验步骤较为繁杂,变异因素多,各个实验步骤的质控均至关重要。至今为止,western blot技术已被广泛用于分子生物学、生物化学等研究领域。

Western Blot技术的基本步骤为根据蛋白质分子量大小、利用凝胶 SDS-PAGE电泳分离蛋白质样品,通过蛋白特异性抗体识别目的蛋白或者特定蛋白磷酸化位点,最终通过分析抗原抗体结合位置和信号强度获得目的蛋白在样品中表达情况。

主要过程:

蛋白质电泳分离 → 转膜 → 封闭 → 杂交 → 显色

目的蛋白的优化(不同的转膜体系):

Western Blot 实验中有半干转和湿转两种不同转膜方法,二者原理相同,都是基于蛋白在电场力作用下在 SDS-PAGE凝胶中定向转移原理,但用于固定胶、膜叠层和施加电场的机械装置不同。

用于液体,半干转较湿转节省了一半以上的时间,且需要液体较少;但是用于蛋白转印时,由于半干转不具有将整个系统完全浸泡在缓冲液中的能力,易出现液体分布不均匀的情况,从而导致转膜效果出现异常,采用湿转系统,则稳定性大大提高。另外,相对于仪器消耗上,半干转消耗仪器快,较依赖仪器;而湿转对仪器要求较低。但是,目前为止,湿转在适用的蛋白分子量上有争议。

Western Blot主要关键点包括转膜和抗原抗体比例,此外,Western Blot 另外一个关键点为特异性抗体对特定抗原的有效识别。抗体识别蛋白特异性位点的过程是一个抗原抗体反应,只有当抗原和抗体比例适当时才出现最大反应,因此需要选择合适的一抗稀释比例。

不同转膜方法、不同抗原抗体比例对磷酸化蛋白表达的检测影响

方法:选择肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)及其磷酸化蛋白作为研究对象,比较半干转印法、湿转法和 不同抗体稀释比例对磷酸化蛋白检测效果的影响。

结果:半干转印法无法观察到磷酸化蛋白信号;同样样品用湿转法能检测出连续信号。因此选用湿转的方法对磷酸化蛋白表达的检测较好。
在选用半干转印法的情况下,改变稀释比。当抗体稀释比为 1:3000 时,结果出现非特异性条带;为 1:5000 时,无非特异性条带且蛋白信号效果较好;为 1:10000 时,条带图像出现弥散且背景较高。因此抗原抗体比例对磷酸化蛋白表达检测有影响。