Western Blot实验中抗体的选择

  ◎当前位置:首页>>技术服务>>Western Blot检测技术服务>>实验抗体选择

  说到Western Blot实验中最重要的问题,很多朋友也都知道是抗体与抗原能否特异性识别,往往就是抗体没有选择好而毁掉整个实验,钱花了不说,还浪费了大量的时间。下面将从高品质抗体的选择、验证数据对抗体的重要性及内参抗体的选择标准等方面给大家支几招。

Western Blot

1、选好品牌,注意渠道

  市面上常见的抗体品牌鱼龙混杂,良莠不齐,导致抗体成为Western Blot实验中的一颗定时炸弹。大部分进口品牌在抗体的质量、特异性、效价及保存条件方面均有不错的保障。但是不少国产品牌的抗体在这方面做得不尽如人意,很多国产品牌抗体都存在特异性不高的问题,导致实验结果出现背景不清晰,非特异性条带多的问题。这里还要再提一下进口品牌国内分装,有些经销商将买来的国外品牌产品通过稀释、分装、重新贴牌之后卖给客户,这样的抗体不说大家都知道怎么样,批间差异较大。需要大家特别注意。

  当然,很多朋友会说国外的品牌贵啊,但是这里我想讲一句,最贵的产品其实是没有效果的产品,所以,这边还是需要大家自己来掂量,总而言之,抗体还是要选择一些一线品牌,质量有保证,同时,不能疏漏供应商的渠道,需要确保其供应链物流的专业。

2、验证数据是否完善

优质抗体还应具备完善的验证数据和详细的信息标注,应该注意以下三点:

(1)、明确标注可以用于Western Blot实验

(2)、有足够的数据支持证明该抗体适用于某一组织或者样本

(3)、明确的抗体建议稀释浓度、该抗体的识别位点是连续的氨基酸序列的一级结构还是非连续性氨基酸的三维结构位点

  品质好的抗体需通过严格的抗原序列筛选及亲和层析纯化流程,确保其特异性和纯度。此外,每支抗体在多种组织样品中经过蛋白芯片、Western Blot、免疫组化、免疫荧光等实验的验证,并获得学术委员会的认证。完善的实验数据支持可避免因信息不完整而造成的选择错误。

3、有效的内参抗体不可或缺

  在Western Blot中,内参可以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差,保证了实验结果的真实可信。大部分杂志要求做Western Blot实验时提供内参数据,来确保实验样本中差异表达量是可信的。一些常见的内参基因及抗体包括β-actin、GAPDH PCNA、α-Tubulin等。这里多说一句,Actin,Tubulin的缺点是有时候会出现复带,比较稳定的还是GAPDH。如果用心看看cell,nature,science上的文章,大多用GAPDH做内参。

  值得注意的是,内参抗体的选择原则还是要回到自己的实验需求上来,根据实验设计来选择适合的内参抗体,下面是整理的一些依据供参考。

内参抗体
选择依据 参考
目的蛋白来源 哺乳动物样本:GAPDH、β-actin、β-tublin
植物样本:Plant actin、Rubisco
目的蛋白分子量大小 目的蛋白分子量最好能与内参蛋白分子量相差 5kd 以上,才能分开目的蛋白和内参,写文章做图也更美观;
目的蛋白定位 膜定位蛋白:Na/K ATPase
核定位蛋白:Lamin B、TBP、Histone H3,PCNA
线粒体定位蛋白:VDAC1/膜孔蛋白 、COX IV
胞质定位蛋白:GAPDH、β-actin、β-tublin (同样适用于全细胞样品检测)
具体实验目的 β-actin 在肌肉组织中含量很少
细胞增殖实验中,c-Jun 由于自身表达变化就不适合做内参
凋亡检测时,不适宜选择LaminB、TBP 等作为内参

另外,许多公司现在都有提供小包装的试用装的福利,可以先验证抗体是否适合实验需求再决定购买。

以上只是一点小小的建议,总之,大多实验室均具备Western Blot的实验能力。但是要得到一份背景清晰、条带明亮、真实客观的实验结果,需要投入大量的时间和精力,没有人能随随便便WB成功。

最后是大家最喜欢的广告环节,钟鼎生物技术人员,在样品处理、转印和抗体稀释比例等操作上具有特殊的技巧,能够为客户的样品量身定制实验方案,同时我们在抗体制备方面同样拥有相当成熟的平台,欢迎来咨询。