western blot杂交检测技术常见问题解析

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western blot FAQ

Western Blot杂交检测

Western Blot实验中为什么选择内参?

答:内参也叫看家基因,在组织或细胞中都会表达,且表达量在不同组织或细胞中几乎是相同的,一般有α-Tublin,β-actin,GAPDH等,在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参。其作用有二:
1. 是看提取蛋白质量的好坏。如果做western的时候,内参照蛋白有条带,而目的蛋白没有,说明蛋白的提取和转膜等步骤没有问题,是目的蛋白的抗体质量不好或者是稀释倍数不对。
2. 是比较客观的说明目的蛋白的表达情况,消除上样量等的误差。不同的样品之间由于蛋白提取的量有差别,可能强阳性的表达跑出来的带很弱。
因此设立内参照,比较不同样品之间的表达情况。

样品要求

答:客户提取新鲜的样品,组织(植物组织、动物组织)、细胞,由钟鼎生物负责提取蛋白。
组织样品:客户提供250-500mg新鲜样品/样
细胞样品:客户提供1×106~1×107细胞/样
以上样品均需要干冰运输。
注:贴壁细胞的处理方法(冰上操作)
1) 转染后的细胞,细胞刮直接刮下来,PBS重悬清洗,吹洗后离心(5000 rpm,4min)去上清-20℃保存,避免反复冻融。
2) 裂解液裂解,裂解后离心(12000 rpm,4min),取上清。

Western Blot实验中为什么检测无信号?(白板)

大概总结为一下几类原因:
(1)样品中目的蛋白丰度很低,低于实验的检测下限
(2)一抗不识别检测物种的蛋白,同时若有阳性参照的话提供阳性对照蛋白,若阳性对照正常则说明抗体及实验参照没有问题,可能是样本中目的蛋白含量比较低。
(3)蛋白降解
(4)待测样品的确为阴性;
(5)一抗失效;
(6)抗原量不足,每泳道蛋白上样量不低于0.1ug

Western Blot实验中为什么检测的结果分子量大小与实际不符?

1. 翻译后修饰—比如蛋白的磷酸化,糖基化等,这些都会增加蛋白的分子量大小。
2.翻译后剪切—比如很多蛋白首先被合成为前体形式,然后通过剪切获得生物学活性
3.剪接变异体—相同的基因,经过选择性剪接会产生不同分子量大小的蛋白。
4.相对电荷—氨基酸的组成 (带电 vs 不带电)
5.多聚体—比如蛋白二聚体。

Western Blot实验中为什么内参条带不一致?

这个是正常现象,理论中样品中内参可以反映总蛋白的含量,内参一致说明上样总蛋白量一致。而理论上,目的蛋白在对应总蛋白中的比例大致相同,所以理论上内参和目的蛋白的比例也在相应组保持一致。同样的,内参不一致的时候,上样总蛋白量相同,但目的蛋白(内参蛋白)在不同样品中提取后的内参蛋白量不一定是完全一致的,所以在进行WB定量分析时会通过内参进行校正分析,最终获得相对的表达量的分析结果。

为什么wb的结果与QPCR结果趋势不一样?

这种情况是比较正常的,WB反映的是蛋白水平的结果,qpcr反映的是基因水平的结果。理论上蛋白水平与基因水平是一致的,但是mRNA的高低不代表其表达蛋白的高低。
也有一些基因可能在组织样品中没有正常翻译,这样即使qpcr检测结果有表达,但是若蛋白没有正常翻译的话,WB则检测不到目的条带。

为什么检测结果有很多杂带?

(1)可能是样品本身体内表达的蛋白具有多种修饰形式如糖基化、磷酸化、乙酰化等;
(2)若是细胞样品,可能是细胞传代次数过多,使其蛋白表达不同,可以使用传达次数少的进行平行实验一起做对照看看。
(3)蛋白降解,导致蛋白分子量降低;
(4)蛋白形成多聚体形式;

为什么WB检测的背景比较高?

(1)可能抗体浓度浓度较高,
(2)抗原量较大。
(3)一张膜中有的目的条带较弱,为了能让较弱条带显示出来,曝光时间较长