western blot杂交实验技巧与心得

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  WB,这一简单古老的免疫印迹实验,却也让科研工作者们抓狂不已,谁也不能保证实验的成功。本文将会从实验操作与实验分析两个方面来整理一些western blot实验中的小技巧和心得,来对western blot的过程进行优化,以提高实验的成功率,希望对大家能有所帮助。

western blot仪器

实验操作

(1)玻璃板注意一定要洗净,最后用双蒸水冲洗,将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾上晾干。或者用70%的乙醇擦干,不要留下痕迹量的水。

(2)分离胶建议不要提前配,不能加入AP和TEMED。储存液避光存放于4℃,可至少存放1个月,临用前加入10%AP及TEMED即可。这种储存液中的丙烯酰胺或多或少会降解,胶浓度多多少少会下降。对于浓缩胶来说,可能无伤大雅,但对于分离胶来说就影响较大。虽然标准的实验方案上讲 10%的AP最好现配现用,如在4℃存放勿超过两周,但实验操作时也未必有太大的影响。可以配好较多的10%AP,分装成1.0 mL, -20℃放置,用前取出一管。

(3)灌入分离胶后应立即封胶,胶浓度<8%时可用0.1%的SDS或水来封胶,浓度 >10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇(有异味,少用),少用0.1%的SDS。封胶后切记勿动。待胶凝后将封胶液倒掉,如用醇封胶需用大量清水及双蒸水冲洗干净,最后用 0.1%SDS洗一次,目的是通过降低张力清除残留水滴。如果用SDS封胶的话,可以不用水洗。将玻璃板倒立放置片刻,或者用滤纸吸掉残余液滴。分离胶不要倒得太满,需要有一定浓缩胶的空间,梳子的孔与分离胶之间应有一定的距离,否则起不到浓缩效果。

(4)灌好浓缩胶一小时后再拔除梳子,特别是室温比较低时胶的凝结比较慢,更急不得;注意在拔除梳子时应边加水边拔,以免有气泡进入梳孔使梳孔变形,或者带着梳子到电流槽,加了电泳跑胶缓冲液后再拔梳子。若上样孔变形,可用适当粗细的针头拨正; 若变形严重,可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出,长时间有利于胶结构的形成。

(5)上样注意平衡一致的原则,加样的时候,没加样品的孔中应加入等量上样缓冲液,避免边缘效应的产生。同时,如果样品中所要分析的蛋白分子量较大,可以采用低电流长时间的方式,尽可能保证样品均一整齐。电泳可采取恒压的方式,低电压过浓缩胶,高电压跑分离胶,但在最后会越来越慢,也可采用恒流的方式,中间不用调电流,跑出来的条带会比较细,如果最后电压升高,胶会越跑越快,一不小心目的蛋白会抛出胶。

(6)转膜前一定要将海绵置于转移缓冲液中泡透。转膜时的温度比较重要,最好保持在10℃一下,可以用冰浴,也可以将转膜系统置于一个大的容器中,外面加入冰水,以确保温度处于低温。最后无论如何,要将海绵泡在热水中,不能让盐离子粘在海绵上,更不能用手去挤海绵中的水。

(7)膜的选择。从结合蛋白的能力看,PVDF膜(100~200μg/cm2)比硝酸纤维膜(80~100μg/cm2)高;就物理强度而言,硝酸纤维素膜较脆,易破碎,而PVDF膜韧性较强;但是硝酸纤维素膜的背景较PVDF膜要低。另外,对于小分子量的蛋白(小于20kDa)一般用0.2μm孔径的膜,而大分子量的蛋白一般用0.45μm孔径的膜。在进行小分子蛋白的分析时,不能按平时通用的转膜条件进行转膜,小分子蛋白极有可能转出膜,通常一个小时就可以。我们曾转反了电极,才15min,大部分预染的蛋白分子标记物就不见了。可见平时的标准实验方案中转膜2h是有点过。

单抗与多抗

(8)一抗的选择。一抗质量是酶免疫组化、免疫荧光和Western Blot等试验中的最关键因素之一。这部分可以参考《Western Blot中抗体的选择》,一抗订购中选择原则有:选择单克隆还是多克隆抗体,前者特异性好,而后者灵敏度高。
选择何种种属来源? 一般兔来源的多数是多克隆抗体;而小鼠来源的多是单克隆抗体,但也有例外。这也决定了你的二抗类型。下表简单列举了一下单克隆抗体与多克隆抗体的区别,更多分析可以参考《如何根据实验需求选择单抗和多抗》这篇文章。

  单克隆抗体 多克隆抗体
制备周期 长(5-6个月) 短(2-3个月)
技术要求
产量
价格
对免疫原要求 较高
特异性 高(抗原亲和纯化)
识别表位 一个 多个
非特异性结合 较少 较多
灵敏度 较高
标准化 易,批间差小 较难,批间差大
稳定性 较好
凝集反应 大多数没有
沉淀反应 大多数没有
中和活性 大多数没有

(9)二抗的选择。一般有生物素标记、HRP标记和荧光素标记的二抗等多种。一抗种属选择好后,那么二抗只能是某种抗-抗种属来源的抗体,如果是酶免疫组化,则可以选择Bio-或HRP-标记,可以买不同公司单独的抗体,也可购买二抗染色试剂盒,包括二抗、SP等;而免疫荧光则可以选择荧光素标记的二抗。

(10)反复冻融抗体。其效价下降会相当之快。因此,新到的抗体必须要分装,同时,要进行优化。如果实验室以前没人用过,则新到的抗体建议做预实验,摸索一下合适的稀释浓度以及这个抗体的效价怎么样。