1.什么是体外转录？

在讨论体外转录之前，首先需要了解转录，转录想必大家已经很熟悉了，在细胞体内以DNA为模板，在RNA聚合酶的催化下合成RNA的过程就叫做转录。那么顾名思义，“体外转录”则是脱离细胞系统，在体外以DNA为模板，以A/G/C/U四种核糖核苷酸为原料，在适当的缓冲液体系中，模仿体内的反应过程，通过RNA聚合酶的催化反应生成RNA的过程。

2.RNA合成产量低或反应失败是什么原因？

(1)可能因为DNA模板中的污染物抑制了RNA聚合酶，T7 RNA聚合酶对盐离子抑制极为敏感，建议对DNA模板重新纯化
(2)模板浓度过低或存在RNase酶污染也会导致反应失败。我们建议在反应中添加终浓度为1unit/ul的RNase抑制剂
(3)在体系中添加5mM DTT（终浓度）也可能有助于提高RNA产量。

3.RNA聚合酶如何选择？

种类	特点	使用场景
大肠杆菌来源的体外转录系统	转录效率低，特异性差	较少使用
Hela细胞核提取物来源的体外转录系统	使用RNA聚合酶Ⅱ启动转录	用于体外转录机制和转录调控机制研究
噬菌体来源的体外转录系统	RNA聚合酶有T7、T3、SP6，特异性高，转录快速，RNA产量高	使用场景广泛，如RNA探针合成、dsRNA合成等

4.T7 RNA聚合酶如何提高RNA的产量？

通过提高NTP浓度，DNA 模板的量和T7 RNA聚合酶的量，可以获得更高的RNA产量。

5.使用T7 RNA聚合酶会产生异常RNA吗？

使用限制性内切酶线性化质粒模板时，目标序列下游产生3’突出端时，会产生异常的RNA。为避免这种情况，应使用产生平末端或5’突出端的限制性内切酶。

6.T7 RNA聚合酶是否可用于非线性化质粒？

可以，但是T7 RNA聚合酶将绕环状模板周围多次转录而不会解离。

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