一、体外转录实验设计

     采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，合成基因A，构建至载体pUC57中；设计引物，扩增目的基因，其中，上游基因的5’端增加T7 promoter序列TAATACGACTCACTATAGGG；扩增获得的产物，采用T7 RNA polymerase转录获得RNA；合成的RNA采用乙醇沉淀法进行纯化后进行RNA纯度分析；冻干保存。

1.体外转录所需试剂和耗材

试剂和耗材
pUC57质粒（Zoonbio）	Top10菌株（Zoonbio）
限制性内切酶（TaKaRa）	2×PCR Mix（Zoonbio）
T7 RNA Polymerase（Thermo公司）	Tyrptone、Yeast Extract（OXOID公司）
Agarose（上海基因公司）	DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒（AXYGEN公司）
PCR管、枪头等耗材（Fisher公司）	其它试剂均为国产分析纯或化学纯

2.体外转录主要实验仪器

主要实验仪器
Allegra 21R台式高速冷冻离心机（美国BECKMAN公司）	台式高速离心机（德国SORVAL公司）
Biologic LP层析系统、Mini Protean II垂直平板电泳系统、Gel Doc2000成像系统、水平电泳系统（美国BIO-RAD公司）	PTC-200基因扩增仪（美国MJ Research公司）
320-S pH计（美国Mettler Toledo公司）	AR5120电子天平（美国AHOM S公司）
MμLtiTemp III恒温水浴锅、Hofer ΜV-25紫外透射仪（美国Amersham Pharmacia公司）	雪花状制冰机（日本SANYO公司）
JY92-2D超声波细胞粉碎机（中国新芝科器研究所）	超净工作台（中国苏净集团）
NANODROP2000（Thermo公司）

3.体外转录实验方法及结果

3.1基因合成目的基因A

3.1.1pUC57-A测序验证

    采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，设计全长拼接引物，将获得的重组质粒pUC57-A转入Top10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果拼接如下所示，单划线区域A基因区域。

GTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGC...此处省略...ACCGTGGGATCCGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCA
TAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCT

图1序列比对结果

3.1.2质粒酶切鉴定

图2 质粒酶切电泳检测
基因名称：A（OD260/OD280:1.82）
酶切鉴定：BamHI - EcoRI
M：Marker（200,500,800,1200,2000,3000,4500 bp）
1：酶切前质粒
2：酶切后质粒

3.2扩增目的基因

3.2.1设计引物

A-F：5’ TAATACGACTCACTATAGGGNNNNNNNNN3’
A-R：5’ NNNNNNNNN3’

3.2.2PCR扩增

PCR反应程序如下：

3.2.3RNA合成产物纯化

（1）加入1/10体积的3M 醋酸钠，充分混匀。
（2）加入等体积的1:1的酚/氯仿，进行混合。
（3）12000 rpm，4℃，5 min。
（4）小心将上清液转移到另一个微量离心管，注意不要吸到中间的变性蛋白质层。
（5）加入2倍体积的酒精，-20℃静置30 min。
（6）12000 rpm，4℃，5 min，弃上清。
（7）加入70-80%的乙醇（室温）1 ml，轻轻倒转2-3次进行混匀。
（8）12000 rpm，4℃，5 min。
（9）弃上清液。
（10）离心沉淀RNA，用移液器完全吸掉乙醇溶液。
（11）加入适量的Nuclease-Free water，用移液器上下吹打使沉淀溶解。

3.3RNA的合成

（1）根据如下体系配置反应液，轻柔混匀。

10×Basal reaction buffer	2 μl
5×Accelerator solution	4 μl
25mM rNTPs mixture	4.5 μl
RNase Inhibitor	0.5 μl
PCR产物	100 ng-1 μg
Thermo T7 RNA polymerase	1μl
Nuclease-free water	up to 20μl

（2）37-42℃静置2 h。

3.4RNA的纯化

（1）在转录产物中加入等体积的TE饱和苯酚（pH 8.0），室温下混匀5 min。
（2）12000rpm，4℃，5 min。
（3）小心将上清液转移到另一个微量离心管，注意不要吸到中间的变性蛋白质层。
（4）在上清液中添加100μl的氯仿，进行混合。
（5）12000 rpm，4℃，5 min。
（6）将上清液转移到另一个微量离心管。
（7）加入250 μl灭菌水和55μl 7.5M醋酸铵。
（8）加入875 μl的酒精，充分混匀
（9）在室温下静置2-3 min。
（10）12000rpm，4℃，5min。
（11）弃上清液。
（12）加入70-80%的乙醇（室温）1 ml，轻轻倒转2-3次进行混匀。
（13）12000 rpm，4℃，5 min。
（14）弃上清液。
（15）离心沉淀RNA，用移液器完全吸掉乙醇溶液。
（16）加入适量的Nuclease-Free water，用移液器上下吹打使沉淀溶解。

3.5RNA的纯度分析

3.5.1电泳检测

图3 RNA电泳检测
M：Marker（100,250,500,750,1000,1500,2000 bp）
1：RNA

 

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