载体表达siRNA的基本步骤

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载体表达siRNA的基本步骤

(1) 合成模板

合成编码siRNA的DNA模板的两条单链,模板链后面接有RNA PolyII聚合酶转录中止位点,同时两端分别设计BamH I和Hind II 酶切位点,可以克隆到pSilencer2. 1-U6载体多克隆位点的BamH I和Hind II 酶切位点之间。

(2)合成编码siRNA的DNA双链退火
按照下列配制反应体系。

编码siRNA的DNA链1 2μg ddH2O 45μL
编码siRNA的DNA链2 2μg 总体积 50μL
5mol/L NaCl 1μL

95℃,5min,缓慢退火,使DNA单链退火得到siRNA的DNA双链模板。

酶切表达siRNA载体

载体 2μg Hind Ⅲ 1μL
10 Xbuffer 3μL ddH2O 23μL
BamH Ⅰ 1μL 总体积 30μL

37℃,2-3h,利用试剂盒胶回收。

连接

T4DNA连接酶 5U 10 X 连接酶Buffer 1μL
线性化载体 2μL 加水补足 10μL
退火后编码 siRNA的DNA 2μL

选择载体和编码siRNA DNA的最佳比例,利用T4连接酶16℃连接4h或过夜。

(5)转化

①将100μL感受态细胞于冰上解冻。
②取5μL连接产物加人到感受态细胞中,轻轻旋转几次以混匀内容物,在冰上放置30min。
③将管放人预加温到42℃的水浴中,热激90s。快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1-2min。
④每管中加700μL LB培养基,37℃ 振荡培养1h,进行复苏。
⑤室温3000r/min离心5min,弃去上清后,用剩余100μL培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意:细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。
⑥将平板置于室温直至液体被吸收。
⑦倒置平皿,于37℃培养,12-16h后可出现菌落。

(6)PCR鉴定和测序鉴定

在插人编码shRNA的DNA双链模板两侧设计鉴定PCR引物,扩增片段在100-200bp之间,并可利用载体上的引物进行测序鉴定。

(7)转染细胞

载体可用常用的转染方法进行细胞转染。按照上述体外合成siRNA的方法进行转染。

(8)检测RNA干扰效率

可以在蛋白水平或mRNA水平检测RNA干扰效率。一般情况下,蛋白质的表达变化与mRNA水平的表达变化一.致,也有少数情况下mRNA表达水平变化不及蛋白质表达下降明显。为检测蛋白质的表达情况,可以使用Western Blot。为检测mRNA表达情况,可以使用逆转录和实时定量PCR。

(9) 筛选稳定表达siRNA的克隆

在转染细胞1-3d后,利用载体携带的筛选标记如G418或puromycin进行筛选,杀死不含有siRNA表达载体的细胞,存活下来的是表达siRNA的细胞。