southern杂交三种转膜方法优缺点比较

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    本文介绍了三种southern杂交中转膜的方法,即向下转移法、电转移法、真空转移法,各自介绍了他们的原理、实验步骤并比较了这三种方法的优缺点,仅供参考。

1.向下转移法

    向下转移法的一个缺点就是胶容易被重物压碎。随着转移进行,由于滤纸长时间浸泡,导致胶承受的压力越来越大,胶更容易碎,更容易延长转膜时间,常常导致转移时间 长达16-24 h。所以我们推荐一种向下转移法,如下图。

向下转移法

    向下转移法通常只需要1 h,适用于各种不同类型的膜,而且还可用高盐或碱件转移缓冲液。以下简介这种方法。

(1)如前所述准备好胶。
(2)在一个玻璃皿中准备好纸巾,要略微大于胶。
(3)按照下图所示,安装好装置。首先将4张滤纸置于纸巾上,用转移液浸润并使其淹过最高点。同时将膜如向上转移法同样处理。膜可以稍微比胶大。
(4)将膜置于顶层滤纸上,轻轻用玻棒赶走气泡。同样地要用塑料膜铺在胶周边,以避免短路。
(5)将胶置于膜上,轻轻赶去气泡。(切勿使胶触及膜的边缘)
(6)将被转移液浸润的滤纸剪成胶样大小,铺于胶上,再铺2张较大的滤纸,如图所示,再将装有转移缓冲液的玻璃皿置于一支持物上,大滤纸另端浸润在转移缓冲液中,如图形成盐桥。
(7)在滤纸上铺上一层保鲜膜,以减少蒸发,再在上加一玻璃板。静置1h。
(8)移去纸巾滤纸等。后续步骤如向上转移法。

2.电转移法

    此法是通过电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。其基本方法是将滤膜与凝胶贴在一起,并将凝胶于滤膜一起置于滤纸之间,固定与凝胶支持夹,将支持夹置于盛有转移电泳缓冲液的转移电泳槽中,凝胶平面与电场方向垂直,附有滤膜的一面朝向正极。在电场的作用下凝胶中的DNA片段向与凝胶平面垂直的方向泳动,从凝胶中移出,滞留在滤膜上形成印迹,如下图所示。该法具有简单、快速、高效转移DNA的特点,尤其适用于用毛细管虹吸转移不理想的大片段DNA。一般只需2-3h至多6-8h即可完成转移过程。但在southern杂交中应用这种方法需注意:不能选用硝酸纤维素膜作为固相支持物;应用循环冷却水装置以保证转移缓冲液温度不会太高;转移缓冲液不能用高盐缓冲液,以免产生强电流破坏DNA。具体步骤如下:

电转移法

按前述毛细管法操作酶切、电泳、变性和中和。

(1)将凝胶浸泡于1×TBE或TAE中。
(2)准备好电转移装置的凝胶支持夹裁剪4张与凝胶大小相同的Whatman 3 mm滤纸和一张尼龙膜浸泡于1×TBE或TAE中。
(3)依次将凝胶、尼龙膜、滤纸和海绵垫叠放在凝胶支持夹中,各层之间不能有气泡滞留。
(4)将凝胶支持夹安放在充满1×TBE或TAE的电转仪中。
(5)尼龙膜一侧置正极,凝胶一侧置负极,300-600mA恒流,4-8h,循环水冷却或置冷室中。
(6)电转移完毕,尼龙膜用1×TBE或TAE漂洗,用干燥滤纸吸干,80℃真空烘烤2h或短波紫外照射固定备用。

3.真空转移法

    此法原理与毛细管虹吸法相同,只是以滤膜在下,凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上,利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中,同时带动核酸片段转移到置于凝胶下面的固相支持物——尼龙膜或硝酸纤维素膜上。具体步骤如下:

(1) 电泳完毕,可以先行脱嘌呤、碱变性,也可以直接进行转移。
(2)在真空转移仪的真空密封膜上剪一与凝胶大小相同或者稍小的窗口。
(3)剪一与凝胶大小相同或稍大的Whatman 3 mm滤纸,用双蒸水浸润,置于上述窗口上。
(4)剪一与凝胶大小相同的尼龙膜或者硝酸纤维索膜,用双蒸水浸润,置于滤纸上, 用玻棒赶去气泡。
(5)将凝胶置于尼龙膜或硝酸纤维素膜上,赶去气泡。
(6)将真空转移仪封严,用Parafilm封牢凝胶周围,使之不会漏气。
(7)接通真空泵,真空压约5.88 kPa,压力过高,如超过5.88 kPa,则凝胶被压缩, 转移效率反而降低。用变性液覆盖满凝胶,抽气约15 min,随时添加变性缓冲液。
(8)换用中和液,继续抽气约15 min。
(9)转移完毕,硝酸纤维素膜或尼龙膜用去离子水漂洗,然后固定。

真空转移法的最大优点是迅速,可在转膜的同时进行DNA变性与中和,整个过程约需 :30〜60 min。但在操作中应注意两个问题:一是真空压力不能太大,若压力过大,凝胶被压缩,转移效率会降低;二是真空转移液要密封严,防止漏气影响压力的产生。以下展示southern杂交中三种转膜方法的优劣。

方法 印迹前凝胶的处理 盐离子的量 操作技术 优点
虹吸印迹法 脱嘌呤(如果靶基因大于5kb),变性中和 20×SSC作为转移缓冲液 目的基因在缓冲液中单向被动转移 灵敏度高,非常可信,且重复性好,转移完全
电转移法 在转移缓冲液中平衡 按厂家使用说明 使用电流增加转移速度 快速转移
真空转移法 与虹吸法同 20×SSC作为转移缓冲液 使用空气压力来增大转移速度 快速转移(大约1h)