体外合成siRNA实验步骤

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体外合成siRNA的基本步骤

  常规化学合成siRNA为21-25nt的双链小分子RNA。即用型的siRNA,已经经过纯化、退火等处理,只要用灭菌的ddH2O或RNasefreewater溶解并配制成20μmol/L液体即可直接转染细胞。

(1) siRNA的转染浓度

   推荐的转染浓度是50nmol/L,可视具体情况优化转染浓度,最佳转染浓度一般设置浓度梯度和时间曲线进行测试,建议优化的转染梯度为100nmol/L、50nmol/L、20nmol/L、10nmol/L、5nmol/L、 1nmol/L。

(2)使用脂质转染试剂2000(Invitrogen)转染siRNA

转染方法请参考转染试剂的使用说明,以下是使用lipofectamine2000转染的参考方法。
①转染前一天,接种适当数量的细胞至细胞培养板中,使转染时的细胞密度能够达到30%~50%(不同细胞的生长速率不一样,因此,接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验),使用无抗生素的培养基。

注意:转染时,细胞密度是影响转染效率的关键因素之--,细胞生长过度会削弱细胞活力,从而降低细胞的转染效率;而细胞密度过低则可能达不到生长的要求,也会因此影响转染效率。

②对于每个转染样品,按如下步骤准备siRNA-lipo2000混合液。

a.稀释转染试剂lipo2000。使用前,将lipo2000转染试剂轻轻摇匀,然后取适量,用不含血清的优化培养基稀释,轻轻混合,室温孵育5min。

b.稀释siRNA。用培养基稀释siRNA,轻轻混合。

c.稀释好的lipo2000经过5min的孵育后,与上述b.稀释好的siRNA轻轻混合,室温培养20min以形成siRNA-lipo2000混合物,溶液可能会有浑浊,不过不会影响转染。注意:稀释好的lipo2000,如果长时间放置可能导致转染试剂活性的降低,应尽量在30min之内与稀释好的siRNA混合。

③将siRNA-lipo2000混合液加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中,轻轻摇晃,使之混合。

④将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养至检测时间(24~96h)。 沉默效率的检测一般建议的时间为24-72h。转染操作完成后,经过37℃培养4~6h,可以将孔里含有siRNA-lipo2000混合液的培养基移去,更换新鲜的生长培养基,这样也不会影响转染的效率。注意:如果转染时使用的是不含血清的培养基(即血清饥饿的条件下进行转染),4~6h后必须换成完全培养基(含血清、含抗生素),以确保细胞生长。

(3)mRNA水平的检测

siRNA的作用机制在于其引起靶mRNA的降解,因此,mRNA的降解水平是siRNA沉默效率的最直接指标。

①一般在siRNA转染24-72h后收集细胞。1ml01XPBS洗1遍后吸去。
②每孔加1mL trizol (1mL per 10cm2), 用枪吹打数次后吸人EP管中。
③室温静置5min后,加200μL氯仿,上下振荡15s,室温静置2- 3min。
④4℃ 12000r/min 15min, 吸取400pL上层无色液体于一新的EP管中,注意宁缺毋滥。
⑤加入400μL异丙醇,上下混匀,室温静置10min, 4℃ 12000r/ min 10min。
⑥缓慢倒出上清,1mL 75%乙醇(用DEPC水配制)洗1次,上下混匀,4℃7500r/ min5min。
⑦缓慢倒出上清,1ml(无水乙醇干燥,注意常温下干燥,管口开向侧面。
⑧待干燥后加40pLDEPC水溶解RNA,测完浓度均用DEPC水稀释为0.35μg/μL,-70℃保存。
⑨进行反转录。

RNA 2μg 6μL H2O 8.9μL
Oligo dT 0.5μg 1μL 总体积 15.9μg

70℃ 5min,迅速放入冰中,使RNA与Oligo dT退火,然后按下列配制反转录反应体系:

M-MLV 5Xbuffer 5μL M-MLV RT 1.0μL
10mmol/LdNTP 2.5μL 总体积 9.1μL
rRNasin inhibitor 0.6μL

将上述两混合物混匀,42℃ 60min反转录,95℃ 5min使反转录酶失活,从而得到25μL cDNA第一链,稀释至100μL (用1/10 TE),存于-20℃。

⑩利用上述得到的cDNA进行实时定量PCR,检测靶基因的表达。注意同时扩增基因β-actin或GAPDH。

(4)蛋白水平的检测

蛋白水平的检测一般需要具有靶基因蛋白质的抗体或针对融入蛋白的抗体,检测手段一般有Western-Blot、免疫组化等。下面以Western-Blot为例详细介绍。

①一般在siRNA转染后24-72h,利用0.5mL 1XPBS洗1遍后,收集细胞。
②3000r/min离心5min,去上清。
③适量RIPA缓冲液重悬细胞,置冰上10min。
④取10pL上述样品,加等量2XSDS loading buffer, 沸水煮10min变性,进行SDS-PAGE。
⑤转膜后分别利用靶基因特异性抗体进行Western Blot, 并同时利用内参抗体检测以校正靶基因表达量。