16srDNA提取与检测方法

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微生物

一、样品总DNA的提取

1、实验操作:

1.1 细胞分裂

称取0.5g样品入含0.3g锆珠、已灭菌的screw-capped tube 中,加入1mL TN150,和150µL 酸性酚,bead-beater匀浆(5000rpm,3min),冰上冷却,加入150µL氯仿/异戊醇,涡旋混匀,10000rpm离心,5min。转移上清液至已灭菌的eppendorf管。

1.2 DNA提取

加入150µL氯仿/异戊醇,和150µLTE饱和酚至上述eppendorf管中。涡旋混匀1min,10000rpm离心1min,上清移入灭菌的eppendorf管中,重复上述步骤直至水相之间的界面清晰为止,上清移入灭菌的eppendorf管中,加入300µL氯仿/异戊醇,10000rpm离心1min,上清移入灭菌的eppendorf管中,加入96%冷乙醇1mL,和50µL3M NaAc (pH=5.2),-20℃沉淀DNA过夜。10000rpm离心20min,弃上清,加入500µL70%冷乙醇溶解沉淀,10000rpm离心5min弃上清。风干沉淀,加入50µLTE缓冲液溶解DNA,-20℃保存提取的DNA。

2、实验注意事项:

酚是致癌物质,实验操作应配带手套,且不要将该溶液洒在桌面上或地面上。实验中使用了挥发性有毒物质,操作应在通风橱中进行。
实验过程中样品应放置冰面上,所有离心操作在4℃下进行。

二、DNA的检测—琼脂糖凝胶电泳

1、实验操作:

1.1、1.2%琼脂糖凝胶的制备:

• 用胶带纸将洗净、干燥的电泳凝胶床的两端开口封好,形成一个胶模,水平放在工作台的位置上,插入样品梳,与底面相距0.5-1mm。
• 称1.2g琼脂糖置于小锥形瓶中,加入100mL 1*TAE稀释缓冲液,加热直至琼脂糖完全溶解(透明溶化液)。待冷却至60℃戴手套操作:小心加入5µLEB染色贮存液,摇匀。
• 将琼脂糖倒入胶模中,倒胶时要避免产生气泡,若有气泡可用吸管小心吸去。
• 待凝固完全后,双手均匀用力轻轻拔出样品梳。
• 取下封边的胶带纸,移入电泳槽,倒入电泳缓冲液直至浸没凝胶面2-3mm。

1.2点样:用微量加样器或可调枪依次将所提取DNA与加样缓冲液(loading buffer)5:1混合后点入加样孔内。

1.3电泳:100mv.电泳15-20分钟。

1.4观察:紫外检测。

2、实验注意事项:

溴化乙锭(EB)是诱变剂,配置和使用时应带手套,且不要将该溶液洒在桌面上或地面上,凡是被其沾污的地方必须专门处理后才可进行清洗和消毒。
加样多少取决于加样槽大小,加入样品体积应略小于加样槽体积。
观测时避免紫外灯对眼睛的伤害。