哺乳动物稳定细胞株筛选

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哺乳动物稳定细胞株筛选

哺乳动物稳定细胞系(stable cell line)是指使用外源目的基因整合到染色体上的稳定表达的细胞,通过外源基因转染真核细胞后整合入基因组DNA,能够长期存在于细胞中,随染色体复制而传给子代,可以稳定表达目的基因的细胞系(cell line)。

相对于瞬时转染来说,稳转转染细胞是将携带了目的基因、组成型启动子、抗性基因、筛选标记、表达增强子等一系列元件的质粒DNA整合到宿主细胞染色体上,使宿主细胞可长期表达目的蛋白。建立稳定的细胞系,是指对靶细胞进行筛选,根据不同表达载体中所含有的抗性标志选用相应的药物,或者是利用基因缺陷的原理进行筛选,最终获得稳定传代的细胞株。

稳定表达细胞系筛选

稳定细胞株筛选服务作为钟鼎生物的传统优势项目,无论是技术标准,还是细胞培养的硬件环境,我们始终保持行业内的顶尖水平。
1、我们技术方向聚焦于高表达稳定细胞株的筛选,可为工业用户和科研用户提供筛选服务。
2、我们目前主要提供基于CHO细胞和293细胞的筛选服务,可选择G418/潮霉素/嘌呤霉素筛选系统的稳转细胞系筛选服务。
3、基于客户的要求和经费预算,可分别提供多克隆稳定细胞株以及单克隆稳定细胞株。
4、严格的交付标准,10代稳定性测序、单克隆批培养、支原体检测等,解决交付稳定细胞株产品的后顾之忧。
5、同时我们还提供细胞库检测病毒灭活/清除验证等生物制品安全性评价服务,对接国内外法规要求

钟鼎生物哺乳动物稳定细胞株筛选服务程序 在线QQ技术支持2

一、载体构建

载体构建服务
载体构建工作 周期 交付材料
A、 密码子优化&基因合成 1~2周 酶切/测序验证报告
B、 亚克隆&质粒制备 1~2周 含克隆质粒的DH10、供体质粒2-4ug
为保护钟鼎技术机密,钟鼎无法提供表达载体质粒,仅提供包含目的基因的克隆质粒。

 

二、表达鉴定及纯化小试

表达鉴定及纯化小试服务
表达鉴定及纯化小试 周期 交付材料
A、 尝试不同的表达培养基 1周 表达优化结果
B、 尝试不同的转染方式
C、最优的条件表达200ml小试 2周 纯化小试得率结果

 

三、稳定细胞系构建

稳转细胞系筛选操作流程
项目 服务内容 服务周期 交付材料
转染 药物浓度摸索、药筛、多克隆鉴定 3周 多克隆鉴定结果
单克隆 挑选表达较好的多克隆3个分别亚克隆,及单克隆生长、单克隆鉴定 3周 单克隆鉴定结果
加压&二检 挑选单克隆最好的20株扩大,进行复检,挑取表达最好的8株 2-3周 二检结果
加压&三检 二检8株细胞扩大,进行复检,挑取最好的3株 2-3周 三检结果
表达评估 稳定性评估(表达量稳定性&细胞增殖及活力稳定性)、批次表达实验、纯化小试 4周 表达量评估结果、稳定性评估结果
建立细胞库 支原体检测、细胞冻存 1-2周 支原体检测结果、细胞株

 

筛选稳定细胞系实验案例数据:

稳定性测试
①相同密度的细胞接种到6孔板,每隔48小时,取样计数,按照相同的密度继续接种,最后进行ELISA或WB检测,确认细胞目的蛋白表达的稳定性。
②稳定性测试进行10代。

稳定表达细胞系筛选 稳定表达细胞系筛选

单克隆批培养
相同密度的细胞接种到摇瓶,每天取样计数,进行ELISA检测,确认生长和表达曲线(3.0 x 10^5 cells/ml seeded in 125ml shaker flask to confirm the growth file and expression titer) 。

稳定表达细胞系筛选

支原体检测

稳定表达细胞系筛选
染色法(Hoechst staining)

稳定表达细胞系筛选
PCR 方法

建库
•根据所有克隆株的确认和冻存的结果,挑选最优的克隆进行冻存建库
•冻存培养基(Freezing medium): 10% DMSO
•冻存密度(Freezing density):> 0.5 x 107 cells/vial

稳定细胞株的应用:

①研究级别的稳定细胞系
·主要的目标蛋白:跨膜蛋白,离子通道,酶等;
·主要用途是基于细胞的测试;
·其他蛋白功能的研究;
②生产、工业级别的稳定细胞系
·主要用于重组蛋白/抗体的大规模生产
·通过基因扩增技术,可以获得高表达的稳定细胞株