southern blot知识普及

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Southern Blot是在分子生物学中常用于检测DNA样品中特定DNA序列的方法。检测方法为将电泳分离的DNA片段转移至滤膜,并随后通过探针杂交进行片段分析。

简要流程

1、使用限制性核酸内切酶将高分子量DNA链切成更小的片段。

2、将DNA片段在琼脂糖凝胶上电泳以按大小分离它们。

3. 目标核酸印迹转移到膜上。
脱嘌呤 → 变性 → 转膜

4、如果一些DNA片段大于15kb,那么在印迹之前,可以用酸处理凝胶,如稀释的HCl,其将DNA片段去嘌呤,将DNA断裂成更小的片段。

5、将DNA凝胶置于碱性溶液中以使双链DNA变性。 碱性环境中的变性可改善带负电荷的DNA与带正电荷的膜的结合,将其分离成单个DNA链以用于随后与探针杂交,并破坏仍可存在于DNA中的任何残余RNA。

6、将一片尼龙膜置于凝胶的顶部。然后使用毛细管作用将缓冲液从高水势区域转移至低水势区域(通常为滤纸和纸巾),以将DNA从凝胶中移出放在膜上。

7、然后将膜在80℃的真空或常规烘箱中烘烤2小时或暴露于紫外线辐射以将转移的DNA永久地附着到膜上。

8、DIG-标记的探针与印迹杂交。
预杂交→杂交
预杂交的目的是将尼龙膜上的非特异结合DNA位点使用与目的DNA同源性较差的分子(鲑鱼精子DNA或者牛血清等)进行封闭。

9、然后将膜暴露于杂交探针 - 具有特定序列的单一DNA片段,其在靶DNA中的存在将被确定。

PCR标记