southern blot印记杂交常见问题解析

southern杂交常见问题解析

1、 针对不同的实验材料,southern杂交实验难度有差异么?

答:不同的实验材料,在进行试验过程中难度差异很大,例如玉米、小麦、葡萄的Southern杂交检测难度要比普通的材料要大。
A、物种本身的基因组较大(例如小麦),检测操作难度大
B、材料本身含有高糖多酚(例如葡萄)严重影响酶切操作
C、物种品系复杂(例如玉米),在基因组信息研究层面还不透彻。

2、核酸质量对southern杂交实验的影响

答:核酸质量对实验的影响是直接的, 既要求客户提供的总量足够——实验消耗(上样量),又要求保证质量——按要求准备材料。
上样量指的是基因组DNA酶切消化后,回收后的DNA片段的量。根据不同物种的基因组大小不同,上样量也有所区别。基因组越大,上样量越多。例如,拟南芥大概需要3ug ,酵母3ug,人8ug,小麦15ug。酶切消化之后不能直接上样,需要回收纯化。回收会有损失,最多能损失一半,所以需要客户提供足够量的样品,一般要求至少20 ug的基因组DNA。(以上上样量均为一个泳道)
DNA 样品一般对 OD 值和浓度有如下要求:OD260/280=1.8~2.0,OD260/230>2.0,浓度≥100 ng/ul 。同时,需要对 DNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳,电泳结果显示该 DNA 样品无蛋白质和 RNA 等物质污染,无降解弥散,条带清晰。(如图1所示)

电泳结果

3、探针设计是怎么回事,有哪些原则?

答:探针就是与待测目的基因序列同源的一段地高辛标记的DNA序列,可以和酶切后的基因组片段特异性的结合。 探针设计有如下几个原则:
A、长度适中。探针的片段长度一般控制在300-1000bp,探针太长时会导致非特异性结合的概率增加,探针太短时,探针结合的地高辛标记物太少,会导致发光信号减弱。
B、特异性强。最佳的探针序列是仅与目的基因同源,与整个基因组序列的同源片段低于30%。
C、ATGC含量均匀,无发卡结构和高度重复序列。

4、让客户提供含有待测目的基因的质粒是为什么?

答:这个质粒有两方面用途:
A、我们需要使用这个质粒为模板,根据待测目的基因序列来设计并扩增探针序列
B、这个质粒经过单酶切后,用作整个实验的阳性对照。

如果客户无法提供含有待测基因的质粒怎么办?

A、我们会根据选取目的基因序列的直接人工合成基因并连入T载体;
B、直接以基因组为模板,扩增目的基因序列或探针片段后连入T载体;
C、以PCR产物作为阳性对照(这里的PCR产物一般对应的是探针序列,探针设计的多长,这里的阳性对照就有多大)。

5、基因组片段化时使用限制性内切酶是怎么选择的?

答:A、目的基因序列中不能含有该位点
B、常用的内切酶,价格优惠、酶切效率高
C、预实验可以把基因组片段化,电泳检测弥散状态看不到明显的主带。
如图2所示:
D、根据转化载体上的酶切位点选择

电泳检测

6、如何减少非特异的曝光条带?

我们采用PCR法合成双链的地高辛标记的探针,电泳检测探针是否标记成功,若条带单一,且略大于对照组,则认为探针合成成功(如图3所示)。
此外,和合成探针前,需要在NCBI上比对探针序列,若没有在待测物种中Blast到高同源性的序列,则认为该探针是特异的。

southern blot杂交

7、检测结果阴性有哪些因素造成的?

答:在southern杂交服务中,大概总结为一下几类原因:
A、基因组中目的基因丰度很低,低于southern blo杂交实验的检测下限(目的基因的量低于0.1pg)
B、在该物种基因组信息不全的状态下,探针序列特异性很难保证,结果出现大量的非特异性条带。
C、基因组质量达不到要求
D、待测样品的确为阴性
E、酶切方案的影响