小分子化合物Pull Down实验案例

摘要

小分子pulldown是一种获取小分子结合靶标蛋白质的实验技术。大致的实验过程为：

1、针对小分子进行脱硫生物素偶联标记；对于结构特殊的小分子化合物，有时需要进行衍生化反应增加偶联位点。
2、提取细胞总蛋白或核蛋白。如果需要分离单独的亚细胞器蛋白，需提前注明。
3、将提取物与偶联后小分子孵育后与链霉亲和素偶联磁珠亲和结合，洗涤去除非特异性结合蛋白分子；洗涤洗脱得到的蛋白产物，通过银染SDS-PAGE检测实验组与对照组的差异情况；达到分离要求的蛋白胶条，通过质谱鉴定即可筛选出与小分子片段可能互作的蛋白信息。

一、试剂和耗材

样品：1个样品

主要试剂：

试剂名称	试剂来源	Cat.No.
Pierce™ IP 裂解缓冲液	Thermo	87787
BCA Protein Quantification Kit	Vazyme	E112-01
Bioeast Mag-SA	博岳生物	M1000S
Complete ULTRA Tablets，Mini，蛋白酶抑制剂混合物	Roche	05892970001
Protein Marker	Thermo	26616
过硫酸铵	南京试剂	7727-54-0
TEMED	Sigma	T8090
Tris	Sigma	T8060
SDS	Sigma	S8010
丙烯酰胺	Sigma	V900845
N,N'-亚甲基双丙烯酰胺	Sigma	V900301
快速银染试剂盒	碧云天	P0017S
生物素	阿拉丁	B105434-25g
CDI	阿拉丁	C109314
0.22 μm无菌滤器	Millipore	KHVES10HH1
透析袋	Millipore	D6191
其它试剂均为国产分析纯。

二、主要实验仪器

仪器名称	来源	Cat.No.
全自动样品快速研磨仪	上海净信	Tissuelyser-48
电泳仪	南京普阳	DYY-7C
电泳槽	北京君意	JY-SPCT
超净工作台	上海上净	CA-1390-1
台式高速离心机	湘仪	H1650-W
台式高速冷冻离心机	湘仪	TGL-16
蛋白电泳仪	北京君意	JY300HC
蛋白电泳槽	Tanon	VE-186
移液器	Eppendorf	2.5 µl/100 µl/ 200µl/1000 µl
NANODROP2000	Thermo	NANODROP2000

三、实验方法及结果

3.1 小分子偶联反应实验方法及结果(示意图)

（1）小分子活化

将6mg小分子溶解于1mL吡啶溶剂中，加入10mg活化剂CDI，室温搅拌1小时，向其中加入50μL去离子水淬灭过量的CDI,得到活化产物。

（2）偶联生物素

取氨基生物素5mg在1mLDMSO中溶解，然后加入到上述活化试剂中，室温搅拌6小时。TLC监测反应进程，待反应完成后，过硅胶柱层析纯化得产物小分子-生物素。

3.2 小分子扫描检测结果

对未偶联小分子及偶联后小分子进行波长扫描
鉴定方法：紫外扫描（001-生物素-绿色，化合物001-黑色）

核磁氢谱

质谱

3.3 总蛋白的提取

(1)将20-100mg组织切成小块，放入离心管中；
(2)用PBS清洗组织，以5000 rpm离心组织5分钟；
(3)使用移液枪小心移除并丢弃上清液，使细胞颗粒尽可能干燥；
(4)将组织样品放入2ml离心管中置于液氮中2-3min，然后用液氮研磨成粉末状，使用Donce均质机或组织研磨机将组织打成粉末；
(5)采用Pierce™ IP 裂解缓冲液（Thermo，货号：87787）提取蛋白，加入cOmplete ULTRA Tablets，Mini，蛋白酶抑制剂混合物（Roche ，货号：05892970001），涡旋使样品完全悬浮，将离心管在冰上裂解15分钟；
(6)在离心机中4℃（16000×g）以最大速度离心20分钟，收取上清；
(7)在使用前，储存在-80℃。
采用BCA法检测蛋白浓度。

3.4 总蛋白银染

图1 SDS-PAGE检测分析图
Fig.1 SDS-PAGE detection analysis
Lane M: Protein Marker
Lane 1: 总蛋白

3.5小分子与蛋白互作

实验具体分组如下：

编号	1	2	3
001	-	+	-
001-生物素	+	-	-
游离生物素	-	+
总蛋白	+	+	+
Bioeast Mag-SA	+	+	+

(1)预先混合2.5µg小分子和100 µg总蛋白，置于冰上；
(2)取50 µl Bioeast Mag-SA，用冰冷PBS洗3次，置于磁力架上分离磁珠和液体，小心的移去上清；
  (3)将小分子与蛋白的混合物加到Bioeast Mag-SA中，重悬珠子； 
(4)4℃孵育1小时； 
(5)置于磁力架上分离磁珠和液体，小心的移去上清，收集磁珠；
  (6)用冰冷PBS洗Bioeast Mag-SA三次，置于磁力架上分离磁珠和液体，尽可能去除上清，收集磁珠；
(7)加入30 µl蛋白上样缓冲液，重悬沉淀，沸水煮10分钟。

3.6SDS-PAGE检测

(1) 样品制备：样品中加入Loading Buffer，100°C 10 min。
(2) 电泳条件：5%浓缩胶：90 V，30 min；10%分离胶：120V，90 min。
(3) 电泳结束后进行银染，拍照记录跑胶图片用于分析。

3.7实验结果

图2 SDS-PAGE检测分析图
Fig.2 SDS-PAGE detection analysis
Lane M: Protein Marker
Lane 1: 001-生物素+Bioeast Mag-SA+核蛋白
Lane 2: 游离001+游离生物素+Bioeast Mag-SA+核蛋白
Lane 3: Bioeast Mag-SA+核蛋白

SDS-PAGE银染结果如上，如需要进一步确认，建议进行后续的LC-MS鉴定。

四、质谱检测:略

五、实验步骤

5.1 蛋白酶解

（1）切胶：将蛋白条带切出后放入EP管中；
（2）水洗：加入MilliQ水wash 1min，离心去上清，水洗2次；
（3）脱色：加入50%MeOH/50mM NH4HCO3于37°恒温箱内脱色30min，离心去上清；
（4）脱水：加入100% ACN ，震荡30s等胶粒变白后吸出液体；
（5）烷基化：往干燥胶粒中加入25 mM DTT/ 50 mM NH4HCO3，于 56度反应30min，吸出DTT，加入55 mM IAA / 50mM NH4HCO3，室温暗处反应30min；
（6）水洗：将IAA吸出，加入MilliQ水wash 3次；
（7）脱水：100% ACN脱水至胶粒变白；
（8）酶切：用25 mM NH4HCO3稀释胰酶至20ng/µl；于每管加入适量胰酶，冰浴30min；再补加适量25 mM NH4HCO3至覆盖胶粒，放入37度恒温箱酶切过夜；
肽段提取：将EP管盒整个放入超声仪中超声15-20min，吸出肽段于新的EP管。

5.2 肽段纯化ZipTip

（1）润湿柱子：吸10µl 100% ACN，弃之，重复两次；
（2）酸化柱子：吸10µl 0.1% TFA，弃之，重复两次；
（3）吸附样本：吹吸样本15次；
（4）除杂质：吸10µl 0.1% TFA，弃之，重复两次；
（5）洗脱样本：吸10µl 0.1% TFA-,700% ACN，将此洗脱液转入新EP管；
（6）真空抽干。

5.3 质谱检测

（1）肽段用样品溶解液（0.1%甲酸、2%乙腈）溶解， 13200rpm，4℃离心20min，取上清，进行质谱鉴定；

（2）液相参数

（a）色谱柱信息：
300 um idx 5mm, Acclaim PepMap RSLC C18, 5 um, 100Å, （Thermo，160454）
Acclaim PepMap 75um X 150mm，C18,3um，100A（Thermo，160321）

（b）流动相信息
流动相A：0.1%甲酸
流动相B：0.1%甲酸，80%ACN
流速：300nL/min

（c）分析时间：65min

有效梯度：B相从5%上升至90%

时间	B相
0	5%
5	5%
45	50%
50	90%
55	90%
65	5%

（3）质谱参数

分离后的肽段直接进入质谱仪Thermo Scientific Q Exactive进行在线检测，具体参数如下：

（a）一级质谱参数
Resolution：70,000
AGC target：3e6
Maximum IT：40 ms
Scan range：350 to 1800 m/z

（b）二级质谱参数
Resolution：17,500
AGC target：1e5
Maximum IT： 60 ms
TopN ：20
NCE / stepped NCE：27

5.4 数据库检索

质谱原始文件经过MM File Conversion软件处理转换，得到MGF格式文件，然后用MASCOT（http://www.matrixscience.com/）检索uniprot数据库，检索参数如下：

项目	参数
固定修饰（Fixed modifications）	Carbamidomethyl (C)
可变修饰（Variable modifications）	Oxidation (M)
酶（Enzyme）	Trypsin
遗漏酶切位点（Maximum Missed Cleavages）	1
一级质谱误差（Peptide Mass Tolerance）	20ppm
二级质谱误差（Fragment Mass Tolerance）	0.6Da
肽段/碎片离子质量数（Mass values）	Monoisotopic（单同位素）
显著性阈值（Significance threshold）	0.05

本实验检索比对数据库：Homo sapiens：https://www.uniprot.org/taxonomy/9606

六、实验结果

6.1 结果文件

本实验结果文件主要包含：
（1）Peptide Summary Report. html
（2）检索结果表格. xlsx

6.2 结果主要参数解释

excel表格包括以下4个子表格：

子表格命名	解释说明
不过滤-原始结果	未经过筛选的原始结果，包括匹配上蛋白和肽段具体信息
不过滤-鉴定及定量蛋白列表	未经过筛选后蛋白列表
0.05过滤-蛋白肽段列表	经过筛选后的原始结果，包括匹配上的蛋白和肽段具体信息，筛选条件为：pep_expect＜0.05
0.05过滤-鉴定及定量蛋白列表	经过筛选后的蛋白列表，筛选条件为：pep_expect＜0.05

蛋白列表参数说明：

参数	说明
prot_hit_num	蛋白编号
prot_acc	蛋白登录号
prot_desc	蛋白描述信息 以Myosin-9 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=MYH9 PE=1 SV=4为例： Myosin-9：蛋白名称；
	OS：Organism，表示检索物种的拉丁名； GN：gene name，表示该基因名是MYH9； PE：ProteinExistence，表示蛋白可靠性，分5个等级，数据越小代表可靠性越高； SV：sequenceVersion，表示蛋白序列版本。
prot_score	蛋白得分
prot_mass	蛋白质量
prot_matches	匹配上的二级谱图数
prot_matches_sig	得分高于阈值的二级谱图数
prot_sequences	匹配上的肽段数
prot_sequences_sig	得分高于阈值的肽段数
prot_cover	蛋白覆盖度（鉴定到的氨基酸数目占氨基酸总数的比例）
prot_pi	蛋白等电点
prot_seq	蛋白序列
emPAI	蛋白丰度指数，指示该蛋白在该样本中所占的丰度大小，数值越大，丰度越高，只能做组内比较，不用于组间比较

肽段列表参数说明：

参数	说明
prot_hit_num	蛋白编号
prot_acc	蛋白登录号
prot_desc	蛋白描述信息
prot_score	蛋白得分
prot_mass	蛋白质量
prot_matches	匹配上的二级谱图数
prot_matches_sig	得分高于阈值的二级谱图数
prot_sequences	匹配上的肽段数
prot_sequences_sig	得分高于阈值的肽段数
prot_cover	蛋白覆盖度（鉴定到的氨基酸数目占氨基酸总数的比例）
prot_pi	蛋白等电点
pep_query	二级谱的提交编号
pep_rank	肽段在二级谱中的排名
pep_isbold	1表示该肽段更可信
pep_isunique	是否是unique肽段（1为是，0为否）
pep_exp_mz	肽段质荷比
pep_exp_mz	肽段质荷比
pep_exp_mr	肽段实际质量
pep_exp_z	肽段电荷数
pep_calc_mr	肽段理论质量
pep_delta	肽段质量偏差
pep_miss	漏切位点
pep_score	肽段得分，得分越高表示该肽段越可信
pep_expect	肽段得分期望值
pep_res_before	在此肽段之前的氨基酸
pep_seq	肽段序列
pep_res_after	在此肽段之后的氨基酸
pep_var_mod	可变修饰类型
var_mod_pos	可变修饰位点，例如某肽段对应的肽段序列为QGFPNR，可变修饰类型为Oxidation (M)，修饰位点为0.010000.0，其中“.”代表酶切位点，0代表未修饰氨基酸，1代表修饰氨基酸，说明该肽段序列中G发生了Oxidation (M)修饰
pep_scan_title	二级谱扫描编号

部分结果展示：

prot_acc	prot_desc
sp|P08779|K1C16_HUMAN	Keratin, type I cytoskeletal 16 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=KRT16 PE=1 SV=4
sp|Q6P5R6|RL22L_HUMAN	60S ribosomal protein L22-like 1 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=RPL22L1 PE=1 SV=2
sp|P52926|HMGA2_HUMAN	High mobility group protein HMGI-C OS=Homo sapiens OX=9606 GN=HMGA2 PE=1 SV=1
sp|Q99755|PI51A_HUMAN	Phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase type-1 alpha OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PIP5K1A PE=1 SV=1
sp|P56537|IF6_HUMAN	Eukaryotic translation initiation factor 6 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=EIF6 PE=1 SV=1
sp|Q8NHW5|RLA0L_HUMAN	60S acidic ribosomal protein P0-like OS=Homo sapiens OX=9606 GN=RPLP0P6 PE=5 SV=1

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