反转录-聚合酶链式反应（Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction, RT-PCR)。其灵敏度比传统的RNA印迹法高1000〜10000倍，而所需时间缩短了几倍。迄今为止，RT-PCR的方法已经广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。

一步法与两步法RT-PCR

常用的反转录PCR方法有两步法（Two-step RT-PCR)和一步法（One-step RT-PCR)两种。两者的区别与特点如下表所示，本文将会以一步法RT-PCR为例，阐述反转录PCR的原理、操作步骤与实验要点。

	一步法RT-PCR	两步法RT-PCR
反应	反应在同一体系进行	独立的逆转录和PCR反应
最佳应用	分析一种或两种基因，高通量检测	分析多种基因
时间/步骤	时间较短，无需开盖移液	时间较长，需开盖移液
试剂盒选择依据	操作简单方便、高通量、污染小	灵活、可获得cDNA

2.实验原理

  RT-PCR是一种从细胞RNA (mRNA)中高效灵敏地扩增cDNA序列的方法，它由两大步骤组成：一步是反转录（RT)，另一步是PCR。获得总RNA或mRNA后，即可进行RT-PCR。首先，在反转录酶作用下将RNA(mRNA)反转录成cDNA，以该cDNA第一链为模板进行PCR扩增，根据靶基因设计用于PCR扩增的基因特异的上下游引物，基因特异的上游引物与cDNA第一链退火，在Taq DNA聚合酶作用下合成cDNA第二链。再以cDNA第一链和第二链为模板，用基因特异的上下游引物PCR扩增获得大量的cDNA。反应原理图如下。

3.操作步骤

  许多公司（如 TaKaRa、Promega、Invitrogen、Qiagen 等）都出售 RNA (mRNA)分离 和反转录PCR试剂盒，并提供详细的操作说明。这里以Qiagen公司Trizol Reagent、Qiagen 公司的 Oligotex mRNA Mini Kit 和 TaKaRa 公司的 TaKaRa One Step RNA Kit ( AMV) 为例，介绍总RNA的提取、mRNA的分离和RT-PCR的操作步骤。

3.1.RNA的提取
(1)50-100mg组织或（5~10)×10⁶个细胞，加入1mL Trizol试剂。对组织来说，需要在匀浆器中匀浆几分钟，至组织完全破碎。对培养细胞来说，可用移液器上下吹打或匀浆机破碎细胞。
(2)4 ℃、12 000g离心10 min,转移上清。
(3)上清室温放置5min，加0.2mL氯仿，用手或Votex剧振15S，室温放置2~3min。
(4)4℃、11 000 g离心15 min,转移水相。
(5)水相中加入0.25 mL异丙醇及0.25 mL高盐沉淀液（0.8mol/L的柠檬酸钠，1.2mol/L的NaCl)混匀，室温放置10min。
(6)4℃、11000 g离心10 min去上清。
(7)加1 mL75%乙醇，Votex混匀，4℃、7000g离心5min，去上清。
(8)沉淀在空气中干燥5~10 min,用100μL DEPC水溶解，枪头吸打几次，放于 55℃水浴中10min促溶。
(9)电泳及检测OD值，检定RNA的量及完整性。
(10)RNA放入-70℃保存。

3.2.mRNA的分离
（1）检测起始RNA的量（起始RNA的量应小于或等于0.25mg）。将总RNA加入一个无RNase的1.5 mL Eppendorf管中，加入不含RNase的水至总体积为250 μL。
(2)加入250μL的Buffer OBB和15μL的Oligotex悬浮液，完全混合溶液。
(3)样品溶液放入70℃水浴中保温3 min。
(4)从水浴中取出样品溶液，室温下放置10min。（这一步允许Oligotex粒子中的 Oligo-dT30 和mRNA的 poly-A 尾巴杂交）
(5)将样品溶液以最大速度（14000~18000 g)离心2min以沉淀Oligotex-mRNA 复合物，用移液器小心除去上清液。
(6)用涡旋振荡器（Votex)或移液器将Oligotex-mRNA复合物沉淀重悬于400 μL 或600 μL Buffer OW2中，然后将这些悬液加入到一个置于1. 5 mL微量离心管中的小离心柱（用于400 μL悬液）或大离心柱（用于600 μL悬液）中，以最大速度离心1 min。
(7)转移离心柱到一个新的不含RNA酶的1.5 mL微量离心管中，然后加入400 μL 或600 μL Buffer OW2到离心柱中，以最大速度离心1 min,并且弃掉离心液。
(8)转移离心柱到一个新的不含RNA酶的1.5mL微量离心管中，加入 20-100 μL Bulfer OEB (70℃预热）到柱子中，用移液器洗打溶液3~4次以重悬柱子上的Oligotex-mRNA复合物，以最大速度离心1 min。
(9)为了获得最大的产量，再加入20-100 μL Bulfer OEB (70℃预热）到柱子中， 然后用同样的方法重悬柱子中的Oligotex-mRNA复合物，以最大速度离心1min。为了减少洗脱体积，可以将第一次洗脱液重新加热到70℃后再用来进行另一次洗脱。但是如果要获得最大量的mRNA，则建议还是用新的Buffer 0EB来洗脱。

3.3.RT-PCR
（1）按下列组成配制RT-PCR反应液。

反应试剂	反应体积（μL）
10 × One Step RNA PCR Buffer	5μL
MgCl2（25 mmol/L）	10μL
dNTP Mixture（各 10mmol/L）	5μL
RNase Inhibitor（40 U/μL）	1μL
AMV RTase XL（5U/μL）	1μL
AMV-optimized Taq（5 U/μL）	1μL
上游特异性引物（20 μmol/L）	1μL
下游特异性引物（20 μmol/L）	1μL
Positive Control RNA或实验样品（≤1 μg total RNA or mRNA）	1μL
RNase Free dH2O	24μL
Total	50μL/sample

（2）按以下条件进行RT-PCR反应。

（3）反应结束后，取PCR反应液（5-10μL）进行琼脂糖凝胶电泳，确认RT-PCR反应产物。如果此PCR产物需要用于以后实验，必将PCR产物放于-20℃冷冻保存。

4.实验要点

参考：《RT-PCR常见问题解析》