RT-PCR实验案例解析

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钟鼎生物技术公司基于与客户合作的实际案例,介绍了RT-PCR的实验流程,包括RT-PCR实验所需试剂耗材、RNA提取、RNA反转录为cDNA。

实验摘要

使用TRIzol提取样品总RNA,反转录获得cDNA,供下游实验使用。

1.试剂与耗材

试剂与耗材
Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit,宝生物工程(大连)有限公司,6210B; 总RNA提取试剂TRIzol,南京钟鼎生物技术有限公司,RK01-100;
DL2000 DNA Plus Marker(100、250、500、750、1000、1500、2000 bp),南京诺唯赞生物技术有限公司,MD101。 GelStain,北京全式金生物技术有限公司,GS101-01;
DEPC,Sigma公司,D5758-25ML; Agarose,西班牙Biowest,91622;
离心管,美国Axygen,311-01-051; 枪头,美国Axygen;
其它试剂均为国产分析纯。

2.主要实验仪器

主要实验仪器
超微量紫外分光光度计:NanoDrop2000,Thermo公司; 台式高速冷冻离心机,美国BECKMAN公司,Allegra 21R;
电子天平,美国AHOMS公司,AR5120; 紫外透射仪,美国Amersham Pharmacia公司,Hofer MV-25;
电泳仪:TY2795型,BIO-RAD公司; 电泳槽:Sub-Cell GT Cell,BIO-RAD公司;
凝胶成像分析系统:GelDocXR型,BIO-RAD公司; 雪花状制冰机,日本SANYO公司,SIM-F140AY65;
移液器,德国Eppendorf公司。

3.实验方法及结果

3.1.RNA提取

(1)组织匀浆:向样品中加入1 ml TRIzol试剂(组织块体积不要超过TRIzol体积的10%),用移液器反复吹打。

(2)将上述匀浆液室温放置5 min,待核酸和蛋白充分解离。每1 ml TRIzol试剂用量的匀浆液中加入0.2 ml氯仿,盖紧管盖,手动剧烈震摇15 s,然后室温静置2~3 min。

(3)4℃ 10,000 g,离心10 min。

(4)小心吸取上层水相(无色)加入到新试管中,同时计算所吸取的水相体积。

(5)加入所吸取水相等体积预冷的异丙醇,盖紧管盖,轻轻摇匀。

(6)室温静置10 min,待RNA充分沉淀。

(7)4℃ 10,000 g离心10 min。

(8)将上清弃除(注意别丢弃沉淀),每管加入1 ml 75%乙醇润洗,盖紧管盖,轻轻晃动离心管,以去除残留的异丙醇和盐份。4℃ 7,500 g离心5 min。

(9)将上清弃除,打开管盖,将RNA 沉淀干燥(室温挥发或真空干燥)。注意RNA沉淀不可完全干燥,否则难以溶解。

(10)将RNA沉淀溶解于适量的无RNase水中。

3.2.RNA琼脂糖凝胶电泳分析

提取好的RNA进行琼脂糖凝胶电泳,电泳图如下所示:

RNA的电泳检测

3.3.RNA浓度及纯度测定

RNA浓度及纯度鉴定

3.4.RNA反转录为cDNA

3.4.1.基因组DNA去除

采用钟鼎公司的DNase I,在RNase free的离心管中配制如下混合液:

基因组DNA的去除

3.4.2.反转录反应

在PCR管中配制下列反应混合液:

反转录反应体系1

65℃反应5 min,冰浴冷却。

在第一步的反应管中配制下列反转录反应液:

反转录反应体系2

反转录反应条件的设置:30℃ 10 min,42℃ 30 min,95℃ 5 min。冰浴冷却。产物至于-20℃冰箱保存。

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