RNA合成原理

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RNA合成原理

RNA合成

化学合成

以核苷或单核苷酸为原料,完全用有机化学方法来合成核酸。由于核苷酸是一个多官能团的化合物,因此,在化学合成RNA中,必须将不希望发生反应的基团保护起来。例如想将图1 中甲、乙两个3′-核苷酸连接起来生成3′-5′-磷酸二酯键,并且要符合甲在乙前的顺序,如果不将某些基团保护起来,势必会发生许多不需要的副反应干扰产物的生成。在这里,只希望核苷酸甲的3′位上的磷酸基团与核苷酸乙的5′位上的羟基反应,因此甲的2′和5′-羟基,乙的2′-羟基和3′磷酸基团都必须保护起来,以排除不必要的副反应。又如图2 所示由核苷酸甲和核苷乙合成二核苷一磷酸的反应式中,R1、R2、R3和R4都是保护基,其作用是使核苷酸甲的3′磷酸基能专一的只同核苷乙的5′羟基反应生成甲-乙顺序的3′-5′-磷酸二酯键。此外,在核苷酸的碱基上如果有氨基(如胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤的环外氨基)也必须加以保护。在DNA合成中,由于脱氧核苷的2′位上是氢而不是羟基,就不必保护。

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除了用图2中的两种原料外,也可以将核苷乙改为5′-核苷酸,并把2′和3′位上的羟基保护起来,同2′和5′羟基被保护的核苷甲上的3′羟基反应(图3)。

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由于这两个反应是通过磷酸单酯和羟基缩合生成3′-5′磷酸二酯,故称为磷酸二酯(合成)法。

在磷酸二酯法中,由于产物为磷酸二酯,磷酸上所剩下的OH基团,虽然化学活性较小,但也能发生反应,因此,当合成的寡核苷酸链逐渐增长时,由这个磷酸OH基团所带来的副反应也愈益严重,使合成产率急剧下降。目前这个方法已基本上被淘汰,改进的办法之一是采用适当的保护基把磷酸上的OH基团也保护起来,再进行连接反应。即如图4 所表示的那样,用甲核苷3′-磷酸二酯(用R5保护磷酸上的OH基团)同乙核苷的5′-羟基反应生成磷酸三酯型的产物,这个方法称为磷酸三酯法。

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另一个改进的办法是采用图5 所示的路线,以保护的亚磷酰胺单体为原料,经1-H-四氮唑活化后与羟基组分连接,先生成亚磷酸三酯,再氧化得到磷酸三酯,称为亚磷酰胺法或亚磷酸三酯法。

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在磷酸三酯法和亚磷酸三酯法基础上发展起来的固相合成法,其基本原理是将要合成的寡核苷酸链的3′末端核苷先固定在一个不溶性的高分子上面,然后再从此末端核苷开始,逐步接长,接长的链始终被固定在载体上,过量的未反应物和分解产物则通过过滤或洗涤除去,每接长一个经历一次循环。当整个链的增长达到所需要的长度后,再将寡核苷酸链从固相载体上切落下来并脱去保护基,经过分离纯化得到所需要的最后产物。

固相合成不仅可以缩短合成的时间,提高总产率,并且由于每一个缩合循环都经过同样的操作步骤,因此可以采用自动控制手段。目前已经设计出多种型号的全自动或半自动的合成机器,其每一次的连接产率达到97~99%,最快的每轮循环不到10分钟,最长的合成片段可到100核苷酸以上。