RNA Pull down实验常见问题解析

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RNA Pull down的实验原理是什么?

  RNA pull down实验与LncRNA的研究是分不开的,为lncRNA生物学功能的验证起到了至关重要的作用,它利用了核苷酸片段与转录因子结合的特性原理,对体外转录目的RNA进行生物素标记,通过生物素与链酶亲和素的非共价结合。将目的RNA固定在磁珠上,当蛋白与核酸发生结合时,形成RNA-蛋白质复合物,将复合物从磁珠上洗脱下来,通过western blot验证及质谱仪检测与核酸结合的蛋白。

视频讲解


非编码RNA(LncRNA)的研究方向都有哪些

DNA水平调控 RNA水平调控 蛋白质水平调控
1.结合转录因子,调控基因表达
2.介导DNA序列甲基化
3.转录抑制:RNA与解链的DNA碱基互补配对
1.ceRNA假说机制:lncRNA-miRNA-mRNA
2.与转录本形成互补双链,干扰mRNA的剪切
与mRNA形成lncRNA-mRNA二聚体,抑制降解
1.磷酸化:参与蛋白激酶对蛋白的磷酸化修饰
2.泛素化:参与泛素修饰酶对蛋白的泛素化修饰和降解
3.组蛋白:调控组蛋白修饰和染色质开放程度,调控转录
4.作为蛋白质结构组分,改变蛋白构象

RNA pull down的实验如何防止RNA降解?

  RNA pull down实验的一大难点就是RNA本身易降解,所以过程中要禁止RNase,以防止降解。因此在整个实验过程中除了EP管、枪头、镊子这些常用的器具需要灭菌,所有试剂均需要DEPC·H2O配置并灭菌!处理后的耗材需要尽快用掉,超过两周则需要重新处理。操作台需要用RNaseZAP擦净,以去除环境中的RNA酶的影响。

实验中RNA与蛋白结合的亲和力低怎么解决?

  首先确定是不是①缓冲环境有没有优化、②裂解完不完全、③磁珠用量、④RNA探针用量这几个方面有问题,依次排除,如果都没有问题,就要考虑是不是RNA连接生物素的效率低的问题,如果是,那么:
(1)可能是RNA纯度不够,需要重新纯化
(2)RNA没有变性完全
(3)连接的时间短,建议连接时间不要少于4小时,必要时可以16℃过夜。

RNA pull down后银染,条带背景深是什么原因?

  考虑是不是SDS-PAGE染色时间过长或者抗体的质量问题,多克隆抗体经常会出现这种情况,最有可能的情况是样品中包含的非特异性蛋白太多了,针对这一点,有以下解决措施:
(1)优化孵育时间、温度、盐浓度等条件
(2)优化缓冲体系,使用严谨性高的缓冲体系
(3)提高裂解液的质量

电泳后看不到蛋白条带是不是就代表RNA与蛋白不互作?

  也有可能是体外转录的RNA序列有问题;样品中蛋白质浓度过低同样难以观测到条带,当然还会存在实验操作失误的问题。

RNA pull down实验前富集LncRNA都有哪些方法?

  富集LncRNA问题其实也就是LncRNA如何被链霉亲和素识别以及如何带上生物素标记的问题,大致上有三种方法:

(1)探针法:
针对该LncRNA的序列,设计生物素标记的探针。此种方法最关键的是探针的特异性,所以最好用Northern Blot检测探针的特异性。 可以结合内源的LncRNA是探针法的最大优势。缺点就是比较贵,需要的样品量大。

(2)生物素标记法:
在LncRNA的5‘端加上T7启动子,利用体外转录试剂盒,可以制备大量的LncRNA。再通过生物素标记试剂盒,就能得到大量的生物素标记的LncRNA。常用的折叠的方法退火,从95℃退火到4℃,大约30秒一度就可以了。

(3)TRSA法:
除了生物素,链霉亲和素还可以识别TRSA结构,因此在LncRNA的一端加上TRSA序列也是不错的选择。

RNA pull down的实验有对照吗?

  有,探针法和生物素标记法的对照都是相应的反义序列:探针的反义序列以及长非编码RNA的反义序列。TRSA法的对照是TRSA序列本身。

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