细胞或组织的总RNA提取实验步骤

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  从细胞里提取出完整RNA并进行纯化,是进行许多基础分子生物学实验研究RNA功能机制方面的研究的首选和关键步骤。包括cDNA文库构建,northern杂交,检测细胞的转录水平,定量PCR,RT-PCR及体外翻译等。本文将会介绍RNA提取实验步骤,供大家参考。

1.方法背景

  从组织或者细胞中提取总RNA的方法是用含有异硫氰酸胍和酚的一种单相液来裂解细胞,异硫氰酸狐是一种常见且有效的蛋白质变性剂,在裂解细胞的同时能有效抑制内源性RNA酶活性。同时加入氯仿产生了第二相(有机相),DNA和蛋白质在有机相中被抽提,低pH值的酚将使RNA留在上层水相中。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩, 随后用乙醇洗涤沉淀,即可去除所有残留的蛋白质和无机盐,最终获得总RNA。

rna提取卡通图

1.细胞或者组织样品匀浆处理

(1)贴壁培养细胞:细胞量为107,无须用胰蛋白酶消化,在去除培养液后,用预冷无菌PBS洗细胞一次,去上清,再加入1mL单相裂解液裂解细胞,可用枪头吹打混匀,使细胞裂解完全,最后转移到1.5 mL离心管。

(2)悬浮培养细胞:细胞量为107,可直接转移到15 mL离心管,500 rpm离心5 min 后;用预冷无菌PBS洗涤1次,弃上清,再加入1mL单相裂解液悬浮细胞沉淀,可用枪头吹打混匀,使细胞裂解完全,最后转移到1.5 mL离心管。

(3)组织样品:解剖所要的组织后,先将这些组织切成小块(100 mg),然后将组织放入盛有液氮的研钵中,用研棒磨碎组织,使组织成粉末状。在研磨过程中要不断添加液氮使组织保持冷冻状态,最后加入1mL单相裂解液裂解组织细胞,再转移到1.5 mL离心管。

2.RNA提取

(1)样品加入单相裂解液后,室温放置5 min,使样品充分裂解。如不进行下一步操作,样品可放入-70℃长期保存。
(2)如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖等,12000 rpm离心5 min,取上清。
(3)按每1mL单相裂解液加入200 μL氯仿,振荡混匀后室温放置15 min,使其自然分相。禁用旋涡振荡器,以免基因组DNA断裂。
(4)4 ℃ 12 000 rpm离心15 min后,样品会分成三层,黄色的有机层,中间层和上层无色的水相,RNA主要在水相中。
(5)小心吸取上层水相,至另一个新的1.5 mL离心管中。不要吸取中间界面,以免DNA和蛋白污染。
(6)在上清中加入等体积冰冷的异丙醇,-20 ℃放置1h以增加RNA沉淀。
(7)4℃ 12 000 rpm 离心10min,弃上清,RNA沉于管底。
(8)RNA沉淀加入1mL 75%乙醇(用DEPC水配置),温和振荡离心管,悬浮沉淀。
(9)4℃ 8 000 rpm离心5 min,尽量弃上清。用移液器小心吸弃上清,注意不要吸走RNA沉淀。
(10)室温晾干5〜10 min,让最后残存的痕量乙醇挥发。RNA样品不要过于干燥,否则很难溶解。
(11)用50 μL DEPC水或者TE溶解RNA沉淀,RNA溶液要放在-70℃保存。纯水和TE均需DEPC处理并经高压消毒。

rna提取

3.RNA定量

  RNA提取完就应该来做RNA定量,RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260 nm波长处有最大的吸收峰。因此,可以用260 nm波长分光测定RNA浓度,OD值为1相当于大约40 μg/mL的单链RNA。如用1cm光径,用ddH20稀释DNA样品n倍并以ddH20为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:
  RNA (mg/mL) =40x (OD260读数)x稀释倍数(n)/1000
  纯RNA的OD260/OD280的比值为1.8-2.0,根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值比1.8低,说明有残余蛋白质、酚或者其他杂质存在;比值比2.0高,则提示RNA有降解。

4.RNA凝胶电泳

  RNA的电泳目的是检测28S和18S条带的完整性和它们的比值,或者是mRNA Smear 的完整性,可以用普通的琼脂糖胶进行。如果28S和18S条带明亮、清晰,没有出现涂抹状片段,并且28S的亮度在18S条带的两倍以上,则可判断认为RNA提取的质量是好的。

5.保温实验

保温实验主要是来检测RNA酶的存在,关于RNA检测以及RNA酶的检测可以参考另外一篇《如何检测RNA》

6.材料与试剂

6.1.试剂

单相裂解液(4 mol/L的异硫氰酸胍,0.1 mol/L的乙酸钠,0.2% β-巯基乙醇,50%饱和酚),氯仿(分析纯),异丙醇(分析纯),75%乙醇(用0.1%的DEPC处理过的无RNA酶的水稀释),DEPC·H2O,TE溶液(10 mmol/L的Tris·HCl,pH8.0,1mmol/L的EDTA),PBS(1×),焦碳酸二乙酯(DEPC),液氮。

6.2.仪器设备

冷冻台式离心机,电泳仪,电泳槽,电热恒温水槽,紫外分光光度计。

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