RNA提取方法

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RNA提取方法

完整RNA的提取和纯化,是进行RNA 方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA 分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。
所有RNA 的提取过程中都有五个关键点,即
1)样品细胞或组织的有效破碎;
2)有效地使核蛋白复合体变性;
3)对内源RNA 酶的有效抑制;
4)有效地将RNA 从DNA 和蛋白混合物中分离;
5)对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。
但其中最关键的是抑制RNA 酶活性。
RNA 的提取目前阶段主要可采用两种途径,1)提取总核酸,再用氯化锂将RNA 沉淀出来;2)直接在酸性条件下抽提,酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA 留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA 的丢失,目前该方法的使用频率已很低。

RNA提取

方法一:总RNA 的试剂盒快速提取

  一些公司推出的总RNA 提取试剂盒,可以用来制备高质量的可用于建库的RNA 。该总RNA 纯化系统采用两种著名的RNA 酶抑制剂,异硫氰酸弧(GTC)和β-巯基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,这样就能显著降低RNA 的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,将促使核蛋白复合体的解离,使RNA 与蛋白质分离,并将RNA 释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA ,则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行,采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA 进入水相,这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA 可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA 沉淀复溶于GTC溶液中,接着用异丙醇进行二次沉淀,随后用乙醇洗涤沉淀,即可去除所有残留的蛋白质和无机盐,而RNA 中如含无机盐,则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。

方法二: 氯化锂法提取总RNA

  本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA 酶,用氯化锂选择沉淀RNA ,其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA ,具有快速简洁的长处,但也存在少量DNA的污染及RNA 得率不高,小RNA 片断丢失的缺陷。

方法三:蛋白酶-热酚法

本方法适合于病毒RNA 的提取

备注:

具体实验,应根据研究对象的性质,提取核酸的用途而对上述方法在操作步骤和试剂使用量上作一定的修改。

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