报告基因的定义和常用的报告基因

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报告基因的定义钟鼎生物技术支持

    报告基因(reportgene)是指一组编码易被检测的蛋白质或酶的基因,把报告基因的编码序列和基因表达调节序列融合,或与其他目的基因融合,在调控序列的控制下进行表达,通过检测报告基因的表达产物来“报告”目的基因的表达调控。

    作为报告基因,在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件:①已被克隆或全序列已被测定;②表达产物在受体细胞中不存在,在被转染细胞中无相似的内源性表达产物;③其表达产物容易被检测到。在转基因、基因转录分析以及药物筛选等领域,由于报告基因技术具有灵敏度高、检测方便等特点,已被广泛的应用。

常用的报告基因

   包括荧光素酶(Luciferase)、 氯霉素乙酰转移酶(CAT)、 β-半乳糖苷酶(β-gal)、 分泌性人胎盘碱性磷酸酶(SEAP)和绿色荧光蛋白(GFP) 等。

   荧光素酶基因来源于萤火虫Photinuspyralis。 该基因编码一个61kDa 的酶,在ATP、氧气和Mg2+存在的条件下氧化D-荧光素,产生的荧光产物可进行定量测定。荧光素酶分析法极为迅速、简单,而且比较廉价、敏感,具有较宽的线性范围。

荧光素酶报告基因服务优势

   氯霉素乙酰转移酶(CAT) 可以催化氯霉素的乙酰化,其乙酰基团由乙酰CoA或由商品分析试剂盒中的n-丁酰CoA提供。可通过多种方法检测乙酰化的氯霉素,例如放射自显影和闪烁计数仪检测14C标记的反应底物,非放射性方法包括ELISA法和利用荧光标记的氯霉素底物、以TLC为基础的方法。

   β-半乳糖苷酶(β-ga1)催化β-半乳糖的水解,用于标准β-ga1分析的底物,包括5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-ga1)和邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)反应生成黄色的产物邻硝基酚,可以用分光光度计进行定量检测,β-ga1通常用于荧光素酶报告基因和CAT报告基因的内部对照。

    分泌性人胎盘碱性磷酸酶(SEAP)的一个重要优点是报告蛋白能够分泌到培养基中,不需要使细胞裂解就可以检测蛋白质的活性。

    绿色荧光蛋白(GFP) 是从水母中分离到的一种28kDa的蛋白质,GFP含有经氧化和紫外或蓝光激发后能发出绿光的一个内肽生色团,所发出的光通常在完整细胞中就可以进行检测,是一种分析报告基因表达的简单方法,被称为“活细胞的分子探针”。

各种报告基因的优缺点
报告基因 优点 缺点
荧光素酶报告基因 简单,灵敏度高 检测仪器较贵
氯霉素乙酰转移酶(CAT) 真核细胞没有背景表达 放射性,操作复杂,限线性围窄
β-半乳糖苷酶(β-ga1) 简单 细菌,血清等内源活性高
分泌性人胎盘碱性磷酸酶(SEAP) 分泌性报告基因 肿瘤等细胞内可能有内源活性
绿色荧光蛋白(GFP) 不需要底物,亚细胞定位 背景荧光较高