荧光素酶报告基因研究进展与应用

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    报告基因(report gene)是指一组编码易被检测的蛋白质或酶的基因,将其编码序列与目的基因序列相融合形成嵌合基因,在调控序列控制下进行表达,通过报告基因产物的表达来“报告”目 的基因的表达调控。作为报告基因必须满足的条件有:

①该基因已被克隆并且全部基因序列已知;
②该基因的表达产物易被定量或定性测定;
③受体细胞中不存在该报告基因产物或者无相似的内源性物质;
④适于基因转录动力学研究和高通量筛选及基因转移的定性研究的报告基因,其表达产物的分析结果应具有很宽的线形范围,即稳定性好;
⑤报告基因的表达产物不干扰其受体细胞正常的生理作用或活性。
    科学研究中常用的报告基因根据其所用检测方法的不同,分为三大类:大多数是编码抗生素抗性蛋白的基因,通过检查表达产物是否具有抗生素的抗性确定基因的表达情况,如氯霉素乙酰基转移酶(CAT);通过检测报告基因产物活性的β半乳糖苷酶、分泌型碱性磷酸 酶(SEAP)、荧光素酶的报告基因等;表达产物通过特定波长的激发而发出不同颜色荧光的荧光蛋白家族类报告基因。

    综合荧光素酶基因在科学研究中的应用发现,作为报告基因,它主要用在基因表达、药物筛选、标记微生物(示踪)、蛋白质相互作用研究、RNA干扰等许多方面的研究中。

荧光素酶在基因表达研究中的应用钟鼎生物技术支持

    基因表达研究主要是通过分子生物学克隆技术,将荧光素酶基因插到预期分析的细胞染色体内,通过单克隆细胞技术的筛选,培养出稳定表达荧光素酶的细胞株。荧光素酶基因通过农杆菌T-DNA 介导转入植物内,启动子携带荧光素酶基因随机插入到转基因拟南芥、烟草、西红柿等植物中,在不同组织和器官中可以观察到不同表达水平的荧光素酶。

筛选药物研究

   近年来,许多科研工作者致力于新药研究与开发的相关工作。利用基于报告基因的功能性新药筛选方法进行先导化合物的筛选,使小分子有机化合物替代生物大分子作为药物成为可能,明显提高了筛选的流通量并在筛选的过程中得到有关细胞内功能性反应的信息。荧光素酶报告基因在药物筛选的研究中可以满足高敏感性、特异靶点、高通量的要求。

荧光素酶基因标记细胞

   近年来,在体外监测细胞生长和增殖,以及与基因表达和信号转导有关的细胞活动的研究中报告基因技术得到了广泛的应用。理论上,机体内任何一种细胞(癌细胞、造血细胞、干细胞等)通过基因转染或直接注 射方法被标记上荧光素酶后,都可以通过闪烁计数器(scintillation counter)或分子成像技术进行定量、定性及体内跟踪研究。这一方法帮助科研工作者了解细胞的增殖反应及其在体内的生长转移,利用细胞(免疫细胞)进行生物治疗等。

标记微生物(示踪)及生物监测

   微生物与宿主之间的互作关系始终是科研工作者所热衷的领域,将荧光素酶基因标记微生物后,就可以对标记有荧光素酶的微生物(如腺病毒、细菌等)进行示踪,方便研究它们在机体内的传播规律及药物对它们的作用。亡的微生物不能表达报告基因,可以通过观察报告基因的消失判断药物疗效。这一方法的建立有助于科研工作者在不同水平深入了解微生物与宿主间的相互作用。

蛋白质相互作用研究

   近年来,随着分子生物学与基因组学的发展,出现了很多新型的基于不同水平的蛋白质互作的研究方法,其中荧光素酶报告基因也在这一方面逐渐发挥作用。科研工作者采用一种新的细胞水平对蛋白质相互作用进行分析的方法。这种方法巧妙地把 荧光素酶基因分成2段,其中一段与包含烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEV)截短序列融合到蛋白质A上,另外一段则与蛋白质B所融合。当这2种蛋白相互作用时,荧光素酶的两部分相互靠近形成有活性的荧光素酶,在有底物存在时出现生物发 光现象。该方法普遍适用于配体诱导的蛋白质互作,如G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶和核激素受体等。这一方法具有高度特异性,可适用于特异的细胞信号通路的研究。

RNA干扰研究

   RNA干扰(RNA interference,RNAi )是指在进化过程中高度保守的,由双链RNA(double - stranded RNA,dsRNA)诱发,同源mRNA高效特异性降解的现象,是一种典型的转录后基因表达调控方式,由于此研究潜力巨大,Science杂志将其评为2001年十大科学进展之一,并名列2002年十大科学进展之首。与此同时,用luc作报告基因研究RNAi也迅速成为研究热点。动物细胞转染周期短,RNAi干扰技术结合荧光素酶基因报告在动物细胞科学研究中得到了非常广泛的应用。一些科研成果为深入研究哺乳动物细胞RNAi现象提供了捷径,也为RNAi技术的应用研究提供了理论参考依据。相对于动物领域来说,荧光素酶基因和RNAi技术的结合在植物领域中的应用受到了一定的限制,主要是由于植物转基因周期较长,操作起来效率较低,因此,荧光素酶与RNAi技术的结合应用较少。

研究展望

   目前很多实验从检测速度、灵敏度和线性范围等方面考虑,采用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶组合的双荧光素酶标记,相比单荧光素酶,可以更好地体现检测结果的精确性。双荧光素酶标记主要应用在遗传毒性检测、信号通路研究和基因转录活性分析等领域。Promega公司提供的检测 双荧光素酶报告基因的试剂盒E1910,为与双荧光素酶报告基因载体相关的实验研究提供了极大的便利,这将会促进双荧光素酶报告基因系统在更广更深的领域发挥作用。荧光素酶与绿色荧光蛋白报告基因结合的双标记组合在研究蛋白质相 互作用的方面也开始逐渐发挥作用。在过去的几 十年中,荧光素酶成像在基因表达研究、肿瘤和转移瘤、细胞内蛋白质互作、RNA干扰研究、标记细胞活体成像等许多方面发挥着越来越重要的作用。由于这些基础研究的不断发展,使得检测活细胞、组织和器官中荧光素酶基因表达的科学成像 仪器也取得了重大进展,在单个细胞、动、植物组织和细胞及转基因动、植物中荧光素酶基因表达可视化已经成为可能。随着研究的深入,在单个细胞内和活的生物体内实时检测基因表达可能是未来的研究热点,那么荧光素酶在活细胞和有机体中实时成像中可以发挥更大的作用。