实时荧光定量PCR技术简介

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实时荧光定量pcr目前已经是生命科学领域的一项常规技术,正如其名,有实时、荧光、定量三大特点。下面本文将会介绍荧光定量pcr技术的原理,优缺点,常用方法以及应用等方面的相关知识

1.荧光定量pcr原理

荧光定量pcr原理是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,最终精确的对起始模板的定量分析。

在PCR反应加入能示踪扩增产物的荧光化学物质,随着PCR反应的进行,扩增产物不断累积,荧光信号强度不断增加。每经过一个循环,收集一次荧光强度信号,得到一条荧光扩增曲线图,从而通过荧光强度变化实时监测产物量的变化。

这里引入两个概念,即荧光阈值和Ct值

荧光阈值

荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在指数扩增阶段任意位置上,但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

荧光阈值

Ct值

Ct值的定义是PCR扩增过程中,扩增产物(荧光信号)到达阈值时所经过的扩增循环次数.

Ct值

荧光定量pcr数学原理

这里要解释的是一个问题,即为什么Ct值与初始模板的量成正比?我们先来看PCR的扩增方程:

N=No×(1+e)n N:产物分子数 No:起始分子数
e:扩增效率 n:循环次数

指数期


Rn=RB+XO(1+e)nRS
第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分子的荧光强度(即单位荧光强度,RS)与分子数目的乘积。

线性方程公式

荧光定量pcr线性方程

如果从标准曲线上得到斜率,就可以算出扩增效率,一般来讲PCR扩增效率在90%-110%之间都是可以用于数据分析的,低于100%是因为PCR反应中存在抑制因素,高于100%可能有一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。

2.荧光定量pcr方法

1、SYBR Green I法

原理

SYBR Green I法原理

SYBR Green I是一种结合到小沟部位的双链DNA结合染料,与双链DNA结合后,荧光增强,SYBR Green I染料只有和双链DNA结合后才发荧光,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

溶解曲线

优缺点

优点 缺点
1.使用方便--不必设计复杂的荧光探针
2.没有序列特异性--可以用于不同的模板
3.便宜
4.灵敏
1.与非特异性产物结合

2、Taqman法

原理

Taqman法原理

该法是最早用于定量的方法,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。>

Taqman法原理图

Taqman探针设计原则

①长度30-45bp,Tm比引物至少高5℃
②尽量靠近上游引物
③5’端不要有G,G会有淬灭作用,影响定量
④3’端必须封闭

优缺点

优点 缺点
1.对目标序列有很高的特异性--特别适合于SNP检测 1.价格较高
2.只适合于一个特定的目标
3.不能进行融解曲线分析
4.背景高

3.荧光定量pcr应用

绝对定量分析

这是荧光定量pcr的直接应用,对病毒以及病菌的浓度、转基因的拷贝数、RNAi基因失活率等进行绝对定量分析

SNP检测分析

(1)对未知SNP进行分析,即找寻未知的SNP或确定某一未知SNP与某遗传病的关系。最有效的方法是对那些含有SNP的DNA链进行测序,确认突变的位置和碱基类别。

(2)对已知SNP进行分析,也就是基因分型,即对不同群体SNP遗传多样性检测或在临床上对已知致病基因的遗传病进行基因诊断。比较成熟的技术有Taqman探针法,尤其适合样品量特别大的情况。

基因表达差异分析

例如比较,经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等),特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差异结果的确证