分子生物学常用贮存液配制

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  本文整合了目前国内重点实验室的分子生物学实验贮存液的配制方法,包括30%丙烯酰胺溶液、40%丙烯酰胺、放线菌素D溶液等34种分子生物学常用贮存液的配制方法。

分子生物学贮存液制备

一、分子生物学常用贮存液的配制

1.30%丙烯酰胺溶液

【配制方法】将 29g 丙烯酰胺和1gN,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之,补加水至终体积为100ml。用滤器(0.45μm孔径)过滤除菌,查证该溶液的pH值应不大于7.0,置棕色瓶中保存于室温。
【注意】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收,其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为它还可能会含有少量未聚合材料。一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子,在丙烯酰胺贮存液中加入大约0.2体积的单床混合树脂(MB-1Mallinckrodt),搅拌过夜,然后用 Whatman 1号滤纸过滤以纯化之。
在贮存期间,丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。


2.40%丙烯酰胺

【配制方法】把380g 丙烯酰胺(DNA 测序级)和20g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中。继续按上述配制 30%丙烯酰胺溶液的方法处理,但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L。
【注意】见上述配制 30%丙烯酰胺的说明,40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定 。

3.放线菌素D溶液

【配制方法】把20mg放线菌素D溶解于4ml100%乙醇中,1:10稀释贮存液,用100%乙醇作空白对照读取OD440值。放线菌素D(分子量为1255)纯品在水溶液中的摩尔消化系数为21,900,故而1mg/ml的放线菌素D溶液在440nm处的吸光值为0.182,放线菌素D的贮存液应放在包有箔片的试管中,保存于-20℃。
【注意】放线菌素 D 是致畸剂和致癌剂,配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作,而不能在开放在实验桌面上进行,谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。药厂提供的作治疗用途的放线菌素 D 制品常含有糖或盐等添加剂。只要通过测量贮存液在 440nm 波长处的光吸收确定放线菌素 D 的浓度,这类制品便可用于抑制自身引导作用。

4.0.1mol/L(腺苷三磷酸(ATP)溶液

【配制方法】在0.8ml水中溶解60mg ATP,用0.1mol/LNaOH调至pH值至7.0,用蒸馏水定容1ml,分装成小份保存于-70℃

5.10mol/L乙酸酰溶液

【配制方法】把770g乙酸酰溶解于800ml水中,加水定容至1L后过滤除菌。

6.10%过硫酸铵溶液

【配制方法】把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中,该溶液可在4℃保存数周。

7.BCIP溶液

【配制方法】把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐(BCIP)溶解于10ml100%的二甲基甲酰胺中,保存于4℃

8.2×BES缓冲盐溶液

【配制方法】用总体积90ml的蒸馏水溶解1.07g盐溶液 BES[N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸]、1.6g NaCl和0.027g Na2HPO4,室温下用HCl调节该溶液的pH值至6.96、然后加入蒸馏水定容至100ml,用0.22μm 滤器过滤除菌,分装成小份,保存于-20℃。

9.1mol/L CaCl2溶液

【配制方法】在200ml蒸馏水中溶解 54g CaCl2·6H2O,用0.22μm 滤器过滤除菌,分装成 10ml 小份贮存于-20℃。

【注意】制备感受态细胞时,取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100ml,用 Nalgene滤器(0.45μm孔径)过滤除菌,然后骤冷至0℃。

10.2.5mol/L CaCl2溶液

【配制方法】在20ml蒸馏水中溶解 13.5g CaCl2·6H2O,用 0.22μm 滤器过滤除菌 ,分装成1ml小份贮存于-20℃。

11.1mol/L 二硫苏糖醇(DTT)溶液

【配制方法】用 20ml 0.01mol/L 乙酸钠溶液(pH5.2)溶解 3.09g DTT,过滤除菌后分装成 1ml 小份贮存于-20℃。

【注意】DTT 或含有 DTT 的溶液不能进行高压处理。

12.脱氧核苷三磷酸(dNTP)溶液

【配制方法】把每一种 dNTP 溶解于水至浓度各为 100mmol/L 左右,用微量移液器吸取0.05mol/l Tris 碱分别调节每一dNTP溶液的pH值7.0(用 pH 试纸检测 ),把中和后的每种 dNTP 溶液各取一份作适当稀释,在下表中给出的波长下读取光密度计算出每种 dNTP 的实际浓度,然后用水稀释成终浓度为 50mmol/L 的dNTP,分装成小份贮存于-70℃。

碱基 波长(nm) 消化系数(ε)[L/(mol·cm)]
A 259 1.54×104
G 253 1.37×104
C 271 9.10×103
T 260 7.40×103

比色杯光径为 1cm 时,吸光度=εM

13.0.5mol/lEDTA(pH8.0) EDTA(pH8.0)溶液

【配制方法】在800ml 水中加入 186.1g 二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na·2H2O),在磁力搅拌器上剧烈搅拌,用 NaOH 调节溶液的 pH 值至 8.0(约需 20g NaOH颗粒)然后定容至 1L,分装后高压灭菌备用。

【注意】EDTA 二钠盐需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0,才能完全溶解。

14.溴化乙锭(10mg/ml溶液)

【配制方法】在100ml水中加入1g溴化乙锭,磁力搅拌数小时以确保其完全溶解,然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中,保存于室温。

【注意】小心:溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性,使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套,称量染料时要戴面罩。

15.2xHEPES缓冲盐溶液

【配制方法】用总量为90ml的蒸馏水溶解 1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027gNa2PO4·2H2O、0.2g 葡聚糖和1gHEPES,用 0.5mol/l NaOH调节pH值至7.05,再用蒸馏水定容至 100ml。用 0.22μm 滤器过滤除菌,分装成 5ml 小份,贮存于-20℃。

16.IPTG溶液

【配制方法】IPTG为异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(分子量为 238.3),在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后,用蒸馏水定容至10ml,用0.22μm滤器过滤除菌,分装成1ml小份贮存于-20℃

17.1mol/L乙酸镁溶液

【配制方法】在 800ml 水中溶解 214.46g 四水乙酸镁,用水定容至 1L 过滤除菌。

18.1mol/L MgCl2溶液

【配制方法】在 800ml 水中溶解 203.4g MgCl2·6H2O,用水定容至 1L,分装成小份并高压灭菌备用。

【注意】MgCl2 极易潮解,应选购小瓶(如 100g)试剂,启用新瓶后勿长期存放 。

19.β-巯基乙醇(BME)溶液

【配制方法】一般得到的是 14.4mol/L 溶液,应装在棕色瓶中保存于 4℃。

【注意】BME 或含有 BME 的溶液不能高压处理。

20.NBT 溶液

【配制方法】把 0.5g 氯化氮蓝四唑溶解于 10ml 70%的二甲基甲酰胺中,保存于4℃。

21.酚/氯仿溶液

【配制方法】把酚和氯仿等体积混合后用 0.1mol/L Tris·HCl(pH7.6)抽提几次以平衡这混合物,置棕色玻璃瓶中,上面覆盖等体积的 0.01mol/l Tris·HCl(pH=7.6)液层,保存于 4℃。

【注意】酚腐蚀性很强,并可引起严重灼伤,操作时应戴手套及防护镜,穿防护服。所有操作均应在化学通风橱中进行。与酚接触过的部位皮肤应用大量的水清洗,并用肥皂和水洗涤,忌用乙醇。

22.10mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)溶液

【配制方法】用异丙醇溶解 PMSF 成 1.74mg/ml(10mmol/L),分装成小份贮存于-20℃。如有必要可配成浓度高达 17.4mg/ml 的贮存液(100mmol/L)。

【注意】PMSF 严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤,吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了 PMSF,应立即用大量水冲洗之。凡被PMSF 污染的衣物应予丢弃。

PMSF 在水溶液中不稳定。应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。

PMSF 在水溶液中的活性丧失速率随 pH 值的升高而加快,且 25℃的失活速率高于 4℃。pH 值为 8.0 时,20μmmol/l PMSF 水溶液的半寿期大约为 85min,这表明将 PMSF 溶液调节为碱性(pH>8.6)并在室温放置数小时后,可安全地予以丢弃。

23.磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶液

【配制方法】在800ml 蒸馏水中溶解 8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4 和 0.24gKH2PO4,用 HCl 调节溶液的 pH 值至 7.4 加水定容至 1L,在 15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌 20min。保存于室温。

24.1mol/L乙酸钾(pH=7.5)溶液

【配制方法】将 9.82g 乙酸钾溶解于 90ml 纯水中,用 2mol/L 乙酸调节 pH 值至7.5 后加入纯水定容到 1L,保存于-20℃。

25.乙酸钾溶液(用于碱裂解)

【配制方法】在 60ml 5mol/L 乙酸钾溶液中加入 11.5ml 冰乙酸和 28.5ml 水,即成钾浓度为 3mol/L 而乙酸根浓度为 5mol/L 的溶液。

26.3mol/L乙酸钠(pH5.2和pH7.0)溶液

【配制方法】在 80ml 水中溶解 408.1g 三水乙酸钠,用冰乙酸调节 pH 值至 5.2或用稀乙酸调节 pH 值至 7.0,加水定容到 1L,分装后高压灭菌。

27.5mol/L NaCl溶液

【配制方法】在 800ml 水中溶解 292.2g NaCl 加水定容至 1L,分装后高压灭菌。

28.10%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液

【配制方法】在 900ml 水中溶解 100g 电泳级 SDS,加热至 68℃助溶,加入几滴浓盐酸调节溶液的 pH 值至 7.2,加水定容至 1L,分装备用。

【注意】SDS 的微细晶粒易扩散,因此称量时要戴面罩,称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的 SDS,10%SDS 溶液无须灭菌。

29.20×SSC溶液

【配制方法】在800ml 水中溶解 175.3g NaCl 和 88.2g 柠檬酸钠,加入数滴 10mol/lNaOH 溶液调节 pH 值至 7.0,加水定容至 1L,分装后高压灭菌。

30.20×SSPE溶液

【配制方法】在 800ml 水中溶解 17.5g NaCl、27.6g NaH2PO4·H2O 和 7.4g EDTA,用 NaOH 溶液调节 pH 值至 7.4(约需 6.5ml 10ml/L NaOH),加水定容至 1L,分装后高压灭菌。

31.100%三氯乙酸溶液

【配制方法】在装有500g TC 的瓶中加入227ml水,形成的溶液含有100%(M/V)TCA。

32.1mol/L Tris 溶液

【配制方法】在 800ml 水中溶解 121.91g Tris 碱,加入浓 HCl 调节 pH 值至所需值 。

pHHCl 7.4 70ml 7.6 60ml 8.0 42ml

应使溶液冷至室温后方可最后调定 pH 值,加水定容至 1L,分装后高压灭菌。

【注意】如 1mol/L 溶液呈现黄色,应予丢弃并置备质量更好的 Tris。尽管多种类型的电极均不能准确测量 Tris 溶液的 pH 值,但仍可向大多数厂商购得合适的电极。

Tris 溶液的 pH 值因温度而异,温度每升高 1℃,pH 值大约降低 0.03 个单位。例如:0.05mol/L 的溶液在 5℃、25℃、和 37℃时的 pH 值分别为 9.5、8.9 和 8.6。

33.Tris 缓冲盐溶液(TBS)(25mmol/l Tris)

【配制方法】在800ml 蒸馏水中溶解 8g NaCl、0.2g KCl 和 3g Tris 碱,加入 0.015g酚并用 HCl 调至 pH 值至 7.4,用蒸馏水定容至 1L,分装后在151bf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌 20min,于室温保存。

34.X-gal 溶液

【配制方法】X-gal 为 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。用二甲基甲酰胺溶解 X-gal 配制成的20mg/ml 的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中,装有 X-gal 溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏,并应贮存于-20℃。X-gal 溶液无须过滤除菌。

二、常用抗生素溶液

抗生素 贮存液 a 工作浓度>
浓度 保存条件 严紧型质粒 松弛型质粒
氨苄青霉素 50mg/ml(溶于水) -20℃ 20μg/ml 60μg/ml
羧苄青霉素 50mg/ml(溶于水) -20℃ 20μg/ml 60μg/ml
氯霉素 34mg/ml(溶于乙醇) -20℃ 25μg/ml 170μg/ml
卡那霉素 10mg/ml(溶于水) -20℃ 10μg/ml 50μg/ml
链霉素 10mg/ml(溶于水) -20℃ 10μg/ml 50μg/ml
四环素 b 5mg/ml(溶于乙醇) -20℃ 10μg/ml 50μg/ml

a:以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理。所有抗生素溶液均应放于不透光的容器保存。

b:镁离子是四环素的拮抗剂,四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基(如LB培养基)。

三、常用的电泳缓冲液

缓冲液 使用液 浓贮存液(每升)
Tris-乙酸(TAE) 1×:0.04mol/L Tris-乙酸 50×:242g Tris 碱
  0.001mol/L EDTA 57.1ml 冰乙酸
    100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
Tris-磷酸(TPE) 1×:0.09mol/L Tris-磷酸 10×:10g Tris 碱
  0.002mol/L EDTA 15.5ml85%磷酸(1.679g/ml)
    40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
Tris-硼酸(TBE)a 0.5×0.045mol/L Tris-硼酸 5×:54g Tris 碱
  0.001mol/L EDTA 27.5 硼酸
    20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
碱性缓冲液 b 1×:50mmol/L NaOH 1×:5ml 10mol/L NaOH
  1mmol/L EDTA 2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)
Tris-甘氨酸 c 1×:25mmol/L Tris 5×:15.1g Tris
  250mmol/L 甘氨酸 94g苷氨酸(电泳级)(pH8.3)
  0.1% SDS 50ml 10% SDS(电泳级)

 

以上就是我们对于分子生物学实验常用的34种贮存液配制方法的整合,更多分子生物学相关,联系我们。