质粒DNA小量提取方法简介

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  不管是质粒小量提取还是质粒大提,其原理都很简单,通过一定方法使在细菌内大量扩增的质粒释放出来,然后按照实验步骤进行纯化,最终将目的质粒提取出来。与质粒大提不同的是,质粒小提常被用于质粒鉴定和对纯度要求不是很高的实验,本文将会介绍质粒小量提取的三种常用方法,包括碱裂解法、煮沸法以及试剂盒法。

质粒提取

三种方法的比较

方法 优点 缺点
碱裂解法 操作简单
得率高
纯度高、污染少
费时
容易导致不可逆变性
煮沸法 操作简单
节省时间
回收率低
条件过于剧烈
试剂盒法 纯度高
快捷高效
成本高
得量少

碱裂解法

  碱裂解法是最常用的小量制备质粒DNA的方法,这种方法是基于DNA的变性与复性差异而达到纯化的目的。碱性使质粒DNA变性,再将pH值调至中性使其复性,复性的为质粒DNA,而染色体DNA不会复性,缠结成网状物质,通过离心除去。

操作步骤

①在5ml无菌LB培养液中接种一个单菌落,37℃培养至饱和状态(过夜);
②取1.5ml培养液以最大转速离心20s,弃上清;
③在沉淀中加入100μl GTE溶液彻底重悬并于室温静置5min;
④加人200μl NaOH/SDS溶液,用指头敲击管壁混匀,放于冰面上5min;
⑤加人150μl 乙酸钾溶液,在涡旋混合器上振荡2s混匀,放于冰面上5min;
⑥离心3 min,然后吸取上清液移入干净的微量离心管中,加0.8ml 95%乙醇,于室温静置2 min;
⑦室温离心1 min,弃上清,用1ml 70%的乙醇清洗沉淀,然后真空干燥;
⑧沉淀用30μl TE缓冲液重溶,于4℃短期保存,于-20℃或-70℃长期保存,取2.5〜5μl进行酶切分析。

注:如有必要,在酶切反应液中加入1 μl 10mg/ml RNA酶溶液以去除污染的RNA。

煮沸法

  煮沸法的原理是利用高温来破坏细菌细胞,同时利用溶菌酶酶解细菌细胞。高温破坏了细胞壁,还有助于解开DNA链,并使蛋白质和染色体DNA变性。温度下降时DNA链恢复成超螺旋。离心去除变性的染色体DNA和蛋白质,最后从上清液中提取质粒DNA。这种方法十分快捷,但是提取出来的质粒DNA质量要比碱裂解法差。

操作流程

①在5ml LB培养液中接种一个单菌落,37℃培养至饱和状态或至少到对数生长期(约6h);
②取1.5ml菌液以最大转速离心20s,弃去上清;
③在沉淀中加入300μl含200μg溶菌酶的STET溶液重悬,在涡旋混合器上震荡混匀,放置在冰上30s-10min;(菌体一定要完全重悬
④将管放入沸水中煮1-2min;
⑤离心15-30min,吸上清移入一个新的微量离心管中;
⑥加入200μl预冷的异丙醇,于-20℃放置15-30min;
⑦以最大转速离心5min,倒转离心管,弹数次,去除上清,真空干燥直至沉淀呈透明状
⑧沉淀用50μl TE缓冲液重溶,于4℃短期保存,于-20℃或-70℃长期保存,取2.5〜5μl进行限制酶酶切分析。

试剂盒法

  试剂盒法是在碱裂解法的基础上发展起来的的方法,其原理经碱裂解获得的含质粒的上清液和高盐的结合缓冲液混合后,加到能高效、专一吸附DNA的特殊硅基质填充的离心吸附柱子中,再离心洗涤杂质,最后将质粒DNA洗脱出来。在提取液中含有RNaseA,可以在提取纯化过程中除去RNA,方便快捷。该方法最大的优势是不用苯酚、氯仿抽提,大大减少对质粒DNA的破坏,且纯度很高。操作方法见各个厂家的操作说明说,在此不作赘述。

  尽管试剂盒法目前已经广泛应用,但是想要提取大量高纯质粒DNA依旧不是一件简单的事,尤其是大分子,低拷贝的质粒DNA,且试剂盒一般价格不菲,所以传统的质粒提取的方法仍然有其用武之地.其实说到底,还是要从原理上去理解质粒提取,针对不同性质、不同菌种和不同大小的质粒,选用合适的方法,有效调控提取过程中的各种因素,这样才能获得高纯度的质粒DNA

  钟鼎生物依据客户需求,可以提供常规质粒提取,高纯度质粒提取以及去内毒素质粒提取,制备的质粒DNA没有RNA的污染,内毒素可低于50EU/mg,蛋白质小于3ug/mg质粒DNA,基因组DNA小于10ng/mg质粒DNA,OD260/OD280介于1.85-1.90之间,超螺旋的比例达到90%以上,满足不同的实验需求。