质粒提取常见问题解析

  ◎当前位置:首页>>技术服务>>分子生物学检测服务>>质粒抽提服务>>质粒提取FAQ

质粒提取

1.测序鉴定正常的细菌,37℃摇菌后质粒大小或序列出现异常怎么办? QQ技术支持

这种情况大多出现在较大或特殊的序列中,出现几率较低。解决办法:

(1)、降低培养温度,建议在室温下培养,可明显减少发生概率。
(2)、使用一些特殊菌株,如Sure菌株,它可以使质粒更加稳定地复制。
(3)、NaOH浓度过高会造成酶切不完全,这在质粒提取中常常被忽略

有两种简单的方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常:

(1)、利用你的嗅觉。平时做实验细心的同学会分辨出大肠杆菌的气味,新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味,而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味,可以和正常菌液对照。

(2)、肉眼观察活化菌株。 对生长异常的菌液进行划板验证或者稀释到足够低的浓度涂板,第二天观察单克隆生长情况,如果观察到生长过快,颜色又是泛黄的话基本上不正常了。

2.未提出质粒或质粒得率较低,该怎么办?

可能原因 方案建议
质粒拷贝数低 更换具有相同功能的高拷贝数载体。
大肠杆菌老化 建议涂布平板培养后,挑选新菌落进行液体培养。
菌体中无质粒 有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在,经多次转接后有可能造成质粒丢失。另外,检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
碱裂解不充分 菌体培养液使用过量会导致菌体裂解不充分,可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒,提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液。
吸附柱过载 不同产品中吸附柱吸附能力不同,如果需要提取的质粒量很大,建议分多次提取。如果用富集培养基,例如TB或2×YT,菌液体积必须减少;若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率,则需减少LB培养液体积。
溶液使用不当 温度较低时可能出现浑浊,最好置于37℃保温片刻直至溶液清亮才能使用。
质粒未全部溶解 洗脱溶解质粒时,建议适当加温或延长溶解时间。
乙醇残留 漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体,再加入洗脱缓冲液。
洗脱液加入位置不当 洗脱液建议加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面以达到最大洗脱效率。

3.从革兰氏阳性菌中提取质粒时在悬浮液中加入溶菌酶有什么用?

革兰氏阳性菌有一层细胞壁,必须加入溶菌酶才能使细胞壁溶解。

4.如何根据实验的实际需要选择不同合适的产品?

从提取量的角度出发:1-20μg,选择小量提取试剂盒;20-40μg,应选择中量提取试剂盒;大于40μg,应选择大量提取试剂盒。

从纯度的角度出发:,包括酶切、PCR、测序、文库筛选、连接和转化这些常规操作,普通纯度的质粒就可以满足要求;但是转染实验,要使用高纯度质粒提取试剂盒才能满足要求。

从宿主菌的角度出发:分为普通细菌质粒提取试剂盒、G+菌质粒提取试剂盒和酵母菌质粒提取试剂盒,根据情况进行选择。

5.细菌离心加入溶液I蜗旋振荡后,菌液浑浊,加入溶液II后,菌液依旧浑浊怎么处理?

(1)、首先确认问题是不是出在在溶液II上。看看10%SDS是否是澄清的?NaOH是否是有效的?如果使用的是试剂盒,也要首先确认溶液II是否澄清没有沉淀?

(2)、细菌浓度过高了,适当调整增加溶液I/II/III的体积。

(3)、“杂菌”污染,如果菌液生长快的离谱,就有可能被杂菌污染。这种情况一般表现为和目的菌有相同的抗性,生长速度异常,能够提出质粒,跑胶的条带也异常的亮,但产物不是自己想要的质粒。