Northern Blot杂交检测实验流程与注意事项

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  Northern Blot杂交技术的原理方法与Southern Blot类似,本文主要介绍Northern Blot分离RNA是在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行RNA电泳实验方案,包括在甲醛-琼脂糖变性条件下RNA电泳的准备,通过上行毛细管转移到尼龙膜或者硝酸纤维素膜,以及使用标记的DNA或者RNA探针杂交检测RNA目的序列。

Northern杂交实验流程

Northern杂交与Southern杂交的区别

Northern杂交与Southern杂交有着诸多类似,却也有显著不同,主要有以下三点区别:

(1)所检测的靶核酸是RNA。Northern杂交可用来对特异性mRNA定量以及确定其分子量,可以提取细胞总RNA直接电泳。总RNA不需要进行酶切,即是以各个RNA分子的形式存在。
(2)RNA电泳。由于RNA是单链,大部分RNA能通过分子内碱基配对而形成二级结构,因此必须在变性条件下进行电泳。碱性溶液会水解RNA的2'-羟基基团,因此不能进行碱变性,而是采用甲醛或乙二醛和二甲基亚砜(DMSO)等进行变性电泳。常用的是RNA在甲醛-琼脂糖凝胶电泳,甲醛与谷氨酸残基的单亚基基团形成不稳定的Schiff 碱基对,这些加合物通过阻止链内碱基配对使RNA维持在变性状态,这种方法电泳速度较快而且对RNA的特异性序列分析方法可靠稳定。
(3)转膜。电泳结束,Northern杂交可以直接用毛细管虹吸法将胶中的RNA转移至膜上,不需要再进行变性和中和。

1.实验方案

1.1.经甲醛变性处理后进行的RNA电泳

(1)加热溶解1g琼脂糖到72ml水中,然后冷却到60℃。
(2)当冷却到60℃左右时,在通风柜中加入1OmL 1OxMOPS电泳溶液和18mL 37%甲醛,开始灌制琼脂糖水平凝胶。
(3)在琼脂糖中设置梳子,然后让胶凝固,取出梳子,把琼脂糖-甲醛胶放到电泳槽,加入足够的1 x MOPS电泳溶液使得液面覆盖凝胶上方1 mm左右。
(4)每一个RNA样品4.5 μL (10~20μg),加DEPC水到11 μL,然后分别加入5μL 10 x MOPS电泳溶液、9μL 37%甲醛、25μL 甲酰胺。
(5)混合均匀后,短暂离心5s,然后65℃孵育样品15 min,冰上制冷,离心(样品)5S,将所有液体沉淀到微型离心管中。
(6)加1/10体积(5μL)的无菌、DEPC处理的甲醛凝胶上样缓冲液,混合均匀后,上样电泳。
(7)电泳5 V/cm,直到溴酚蓝跑到凝胶的2/3时结束电泳。
(8)电泳结束后,切下分子量标准参照物的凝胶条,浸入溴化乙锭溶液(0.5 μg/mL,用0.1 mol/L乙酸铵配制)中染色30〜45 min。在凝胶放置一把透明尺,在紫外灯下照相并测量照片上每个RNA条带至加样孔的距离,以RNA片段大小的1g对数值对RNA条带的迁移距离作图,用所得曲线计算从凝胶移到固相支持体后通过杂交检出的RNA分子的大小。

1.2.变性RNA在膜上的转移和固定

(1)把凝胶转移到无RNA酶污染的玻璃皿内,用解剖刀片修整凝胶的无用部分,在凝胶左上角切去一角,以作为下列操作过程中凝胶方位的标记,再加入DEPC水淋洗数次,以除去甲醛。
(2)加入10倍体积的0.05 mol/L的NaOH和1.5mol/L的NaCl到玻璃皿中浸泡30min,然后去除,再加入10倍体积 0.5mol/L 的 Tris·Cl (pH 7.4)和 1.5mol/L 的 NaCl,浸泡30min以中和。
(3)去除溶液后,加入10倍体积20xSSC,浸泡45min。
(4)用长和宽均大于凝胶的玻璃板作为平台,将其放入大的干烤皿内,上面放一张 Whatman 3 mm滤纸,倒入20 xSSC使液面略低于平台表面,当平板上方的3 mm滤纸温透后,用玻棒赶出所有的气泡。
(5)用剪刀裁一张硝酸纤维素滤膜或者尼龙膜。滤膜的长度和宽度应分别比凝胶大 1 mm。接触滤膜时须戴手套或用平头镊子,用油腻的手接触过的硝酸纤维素滤膜不易浸湿。
(6)将硝酸纤维素滤膜浮在去离子水表面,直至滤膜从下向上湿透为止,随后用20 xSSC浸泡滤膜至少5 min,用干净的解剖刀片切去滤膜一角,使其与凝胶的切角相对应。
(7)将凝胶翻转后置于平台上湿润的3 mm滤纸中央,3 mm滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。
(8)用Parafilm膜围绕凝胶周边(不是覆盖凝胶),作为阻止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中的屏障。

Parafilm膜

(9)在凝胶上方放置湿润的硝酸纤维素滤膜或者尼龙膜,并使两者的切角相重叠。滤膜的一条边缘应刚好超过凝胶上部加样孔一线的边缘。滤膜置于凝胶表面适当位置后,就不应轻易移动,滤膜与凝胶之间不应留有气泡。
(10)用20XSSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的3 mm滤纸,轻轻地放置在湿润的硝酸纤维滤膜上方。用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。
(11)切一叠(5~8 cm高)略小于3 mm滤纸的纸巾,将其放置在3 mm滤纸的上方。并在纸巾上方放一块越境玻璃板,然后用500g的重物压实。其目的是建立液体自液池经凝胶向硝酸纤维素滤膜的上行流路,以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在硝酸纤维素滤膜上。
(12)使上述RNA转移持续进行6h或者过夜,每当纸巾浸湿后,应换新的纸巾。
(13)转移结束后,揭去凝胶上方的纸巾和3 mm滤纸,翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜,以凝胶的一面在上,置于一张干的3 mm滤纸上,用一支铅笔在滤膜上标记凝胶加样孔的位置。
(14)从硝酸纤维素滤膜上剥离凝胶弃之。以20xSSC溶液于室温浸泡滤膜5 min, 这一步可以除去粘在滤膜上的琼脂糖碎片。从20 xSSC溶液中取出滤膜,将滤膜上的溶液滴尽后平放在一张纸巾上。于室温晾干30 min以上。为估计RNA的转移效率,可将胶置于溴化乙锭溶液中染色45min,于紫外灯下观察。
(15)将晾干的滤膜放在两张3mm滤纸中间,用真空炉于80℃干烤0.5〜2h。如干烤时间过长,滤膜极易脆裂并可能发黄。如果滤膜并不立即用于杂交实验,可用铝箔宽松地包裹起来,在真空下贮存于室温。

1.3.探针标记

(1)取25ng模板DNA (适当增大加入量)溶解在5~20 μL蒸馏水中,沸水浴加热 5 min,然后立即冰上制冷。
(2) 冰上加入以下试剂:
1 μL dATP
1 μL dGTP
1 μL dTTP
10 μL 随机引物缓冲液(Random Primer Buffer)
3 μL 50 μCi, [a-32P] dCTP, 3000 Ci/mmol/L-1
1 μL Klenow 酶(5 U/μL)
加蒸馏水至总体积50μL,用移液器轻轻混匀,短暂离心。
(3) 25 ℃温育1 h。(温育时间大于1 h可以产生较高的特异性)
(4) 加人5 μL 0.2mol/L的EDTA后65℃加热10 min终止探针标记反应。

1.4.杂交和放射自显影

(1)室温浸泡膜于2 × SSC中15min,然后倒掉液体,加入7.5 mL 预杂交液。42℃在摇床上摇摆预杂交4 h。
(2)将标记的探针100℃变性5 min,冰浴5 min,再加入到杂交液中
(3)42℃ 杂交 16h。
(4)倒掉杂交液,加入等体积的2×SSC/0.1% SDS室温洗膜15 min。
(5)0.2xSSC/0.1%SDS,55℃洗膜3次,每次15min,除去非结合探针以减少背景。
(6)去除洗脱液后,将膜放在双蒸水中漂洗片刻,用滤纸吸去膜上水分,用保鲜膜将膜包好。
(7)在暗室中将杂交膜和X光片放入增感屏内,密封后放在-80℃中放射自显影48 h。
(8)显影和定影:暗室中显影10 min,定影20 min。

2.注意事项

  在Northern杂交Southern杂交之间最大的区别在于一开始的凝胶分离步骤。因为单链RNA容易形成二级结构,因此RNA样品在电泳时必须在变性条件下才能获得好的分离效果。总RNA和poly(A+) RNA都能用于Northern Blot,不过总RNA效果会差点因为非特异性杂交会使背景变深。Northern Blot能够检测到约5 pg RNA量,而通常mRNA量只占总RNA的0.5%。因此要得到大于5 pg mRNA,起始总RNA量要大于100ng。

3.预期结果

  使用硝酸纤维素膜或者尼龙膜,标记的探针≥5×108dpm/g,Northern Blot将能检测到10 μg总RNA中0.01% mRNA或者3 g poly(A+)RNA中的0.0002%目的mRNA。