CHO细胞表达常见问题

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CHO细胞表达常见问题

问:请问有人养过CHO细胞吗?文献报道说用DMEM培养基来养,但我不太清楚具体是高糖还是低糖?

参考见解:CHO细胞用高糖DMEM养就可以了,比较好养,10%血清,小牛和胎牛都可以,长得比较慢,跟你所用的血清有一定的关系,大概需要两天传一次代。在塑料板上比玻璃板上好养,感觉如果在玻璃板上养而且不包被的话,好像细胞不易伸展开来。

问:要转染钾通道pcDNA3.1入细胞,是选cho细胞呢还是hek293细胞?cho细胞转染效率高吗?

参考见解:表达一个蛋白的时候,首先要确认你的蛋白确实表达了,因为有很多原因可以导致蛋白表达出问题(质粒序列有错误,质粒纯度低,表达的蛋白不稳定,转染效率太低等)。所以在做任何功能性实验之前,必须要先确认蛋白的表达,通常的实验有:

(1)采用免疫荧光法。由于需要荧光二抗,比较贵。但直观,可以确定转染效率,采用好的显微镜时,可以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。
(2)WESTERN-BLOT。可以确认表达的蛋白分子量,以及表达的量。但不直观。
(3)构建一个N或C端带荧光蛋白的质粒。这样比较费时间,同时携带的荧光蛋(通常使用GFP)有可能干扰蛋白的正常功能。但好处是转染后可以很方便的观察转染效率,蛋白在细胞中的位置等。
当然以上方法都无法知道质粒有无发生突变,所以如果你的蛋白有表达但没有功能,首先要做一个DNA测序确认你的序列没有问题。事实上质粒发生突变的机会比大多数人想象的要多得多!

问:由于我要用CHO细胞生产基因工程抗体,用什么培养基能够很好的使之良好的生长

参考见解:培养CHO细胞最好用F12,并且由于F12中加入了一些微量元素与无机离子,因此可以在血清很少的情况下应用,是无血清培养中常用的基础培养基,特别适合进行单细胞培养和克隆化培养。我们的前辈曾用F12在无血清的条件下成功的克隆出CHO细胞。
无血清培养CHO细胞有两种方法:一种是直接向试剂公司购买只适用于培养CHO细胞的无血清培养基(好像HyClone就有);第二种方法实际上是有血清培养,只不过血清浓度很低罢了,可以近似的认为无血清。在第二种方法里,又可以分出两条途径:你可以分步进行,也可以一步到位。分步法是,CHO细胞先在含10%血清的常规培养基里培养,再到含5%血清的培养基里培养,再到含2.5%血清的培养基里培养,依此类推,培养基里的血清不断下降,直到一个能让CHO细胞良好生长的最低血清浓度。一步到位法就是省去中间的步骤,直接由起点的血清浓度到终点浓度。

问:我要做稳定转染,表达融合蛋白并将蛋白质纯化来检测其功能。仅仅把目的基因插入pcDNA3.1,没有插入其他的基因或者tag。现准备转染CHO细胞。就相关问题想问问:有的文献上没有署名K1或是DHFR,普通所写的CHO细胞是指那种?野生型CHO细胞又是指的哪种?这三种细胞是不是因为CHO-K1和CHO/DHFR-有扩增基因GS 和DHFR,可以更为有效的扩增进而表达,比野生型CHO在转染中更起作用?如果就我的实验要求,CHO-K1或者CHO/DHFR-更加适合,那么转染CHO-K1是不是可以直接转染?而转染CHO-DHFR-需要和携带DHFR-的标记质粒共转染?

参考见解:做稳定表达是需要把目的基因克隆到一定的载体上的,这个载体同时可以过表达一个抗性基因,如果载体整和到基因组上,这个抗性已经能够克服筛选压力,而这个时候你的目的蛋白也得到了有效的表达。
(1)野生型CHO就是CHO-K1
(2)CHO-DHFR-是指DHFR缺陷型细胞,DHFR作为筛选标记.
(3)你用pcDNA3.1的话,可以直接转染CHO-K1,加G418筛选即可.