慢病毒表达载体

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    慢病毒是逆转录病毒的一种,具有逆转录病毒的基本结构,但也有不同于逆转录病毒的组分和特性,作为基因治疗载体发展起来,最近已用于转基因动物的制备。

慢病毒

载体的特性如下

    ①基于HIV的病毒载体中包括RSV-5'LTR 复合启动子,这使得在293T包装细胞中能够大量表达全长的假病毒质粒。
    ②均包含包装、转染、稳定整合所需的遗传信息(cPPT、 GAG、LTRs)。
    ③SV40复制原点以保证慢病毒质粒在包装细胞293T细胞中的稳定表达。
    ④pUC复制原点以保证质粒在大肠杆菌中的高拷贝复制。
    ⑤氨苄抗性作为在大肠杆菌中的筛选标记。
    ⑥WPRE元件增强CMV驱动的转录子的翻译的稳定性。
    ⑦SV40的多腺嘌呤信号使得转录及重组转录子的过程有效地被终止。
    ⑧定位于3'LTR的U6表达盒保证了在大多数细胞株中shRNA能够保守并有效的转录,这种转录依赖于RNA聚合酶II。
    ⑨CMV启动子保证了高水平表达GFP (荧光报告基因)、新霉素(药物筛选标记),分别用于转染细胞的筛选和检测。

    慢病毒包装系统,包含pPACK- REV、pPACK-GAG和pVSV-G三个质粒。目前,获取有感染性而无复制能力的慢病毒颗粒的最常用的方法是将慢病毒表达载体和包装质粒同时转入包装细胞中,从而瞬时表达慢病毒表达载体的转录子以及包装所需的蛋白质。在包装细胞中,表达载体中的高效复合启动子CMV/5'LTR (或者RSV/5'LTR)启动表达大量的包装所需的所有功能元件(例如:Psi、RRE和cPPT)。在pKCPACK质粒表达的辅助蛋白的帮助下,表达载体的转录子被高效地包装到VSV-G假病毒颗粒中。48~72h后,测定包装细胞产生的假病毒颗粒浓度,冷藏,待用于后续实验。

    为了有效地包装,建议尽量提供优化后的293T包装细胞株,通过引入SV40大T抗原而保证包装细胞产生高滴度的假病毒颗粒。

    pPACK包装质粒混合物是pPACK-GAG、pPACK-REV和pVSV-G三个质粒按一定比例混合而成的。pPACK-GAG、pPACK-REV载体包括结构基因(gag)、调节基因(vif、gp4、rev和nef)和复制基因(pol), 这些基因编码产生慢病毒所需的蛋白质。pPACK-GAG、pPACK-REV载体中删除了编码病毒包膜蛋白的env基因,该基因决定病毒的感染性。pVSV-G载体中通过CMV启动表达疱疹性口炎病毒的包膜糖蛋白(VSV-G) 以代替慢病毒的包膜蛋白。VSV-G蛋白假型病毒颗粒通过与膜结合后和细胞质膜融合,从而感染哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞。

    慢病毒表达载体和pPACK包装质粒组成了第三代慢病毒表达系统。基于HIV的表达系统增加了生物安全性,表现在以下几个方面。

    ①删除了3'LTR的U3区域的增强子,这保证了质粒转人并整合到宿主细胞的基因组后会自失活。
    ②基于HIV的表达载体中的RST启动子,上游的5'LTR保证了Tat非依赖性的病毒RNA的产生,从而降低HIV-1病毒中部分基因的表达。
    ③病毒包装、复制和转染所需的基因数量降低到三个,仅包括gag、pol 和rev;并且,相关的蛋白质由不同的包装质粒表达,这些质粒缺失包装信号,而且与任何慢病毒表达载体都不具有明显的同源性。pKCVSV-G表达载体及其他载体都不会产生重组的具有复制能力的病毒。
    ④HIV-1病毒基因(gag、 pol 和rev)都不会出现在包装好的病毒基因组中,因为表达这些基因的包装质粒都缺失包装信号,因此,产生的慢病毒颗粒都不具备复制能力。

    假型病毒颗粒都只携带表达载体的一个拷贝。尽管具有上述的安全性特性,但是基于HIV的表达载体根据NIH标准仍然只属于二级生物安全防护水平,因为该系统仍存在潜在的生物安全隐患: HIV 表达载体可能与内源的病毒序列重组,形成可自我复制的病毒;并且存在插人突变的可能性。