GST-pull down 常见问题

GST-pull down 技术在应用中常见的问题 QQ技术支持

  GST-pull down 在体外验证蛋白间直接的相互作用时有较强的特异性的优势,但其也有很多缺点,GST-pull down 技术不能够筛查高通量的蛋白之间的相互作用;内源性蛋白的干扰容易使实验结果出现假阳性。因此往往在实验中要考虑可能对实验结果造成影响的因素。以下几点是进行 GST-pull down 实验时应当考虑的。

1、高纯度

  高纯度的融合蛋白能减少实验结果的假阳性,因此获得高纯度的融合蛋白对于 GST-pull down 实验的结果分析就至关重要了。另外,为了能最大幅度地保证融合蛋白原有的生物学活性,一般要尽可能的获取可溶性融合蛋白。下面对可溶性蛋白的获得条件进行简单的分析。

1. 1 载体的选择

  载体的选择对融合蛋白有很大的影响,不同的实验需求对应的载体构建也是不同的。pGEX 载体所带的 GST 标签能够使融合蛋白易于表达纯化。此外, pGEX 载体由于具有 Ptac 位点,能够被 IPTG 诱导表达,同时还具有控制过表达的 lacI q 位点,能够保证目的蛋白的高质量表达,因而成为目前构建 GST 融合蛋白最常用的原核表达载体。随着分子生物学的不断发展,该载体已经改造出不同的亚型,可以满足不同的实验需求。

1. 2 可溶性融合蛋白表达条件的选择

  蛋白表达的过程非常复杂,除了与表达载体有关外,影响蛋白可溶性表达的因素还包括诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度。不同的融合蛋白需要的可溶性表达条件不同 ,因此,摸索出融合蛋白可溶性表达的最佳条件是很有必要的。

1. 2. 1 诱导温度

  不同诱导温度下融合蛋白存在的形式都不一样。高温诱导适用于温度敏感型表达载体,温度敏感型的突变体要在 42 ℃时才会发生转录作用。多数情况下是在低温下获得可溶性蛋白。低温有利于促进蛋白的正确折叠,容易获得可溶性的蛋白,而较高温度则易形成包涵体。对于常用的载体而言,由于蛋白间存在较强的温度依赖性疏水作用,温度高时蛋白易聚集形成沉淀,这会增加了蛋白形成包涵体的可能。有文献报道,降低温度能减慢蛋白合成的速率,改变多肽折叠的动力学,从而增加蛋白的正确折叠 。但是温度并非越低越好,温度太低会使细菌的生长速度变慢,甚至停止生长,从而影响融合蛋白的表达。

1. 2. 2 诱导时间

  诱导时间分为加入诱导物的时机和加入诱导物后的诱导时间。对于加入诱导物的时机,一般选择在细菌生长的对数期,即通常所说的菌液吸光值 A 600 = 0.6 ~ 0.8 时选择加入诱导物。这个时期细菌生长速度快,生命活力比较旺盛,此时加入诱导物能获得较多的可溶性融合蛋白。但这个范围并不适合所有的表达系统,根据获取的融合蛋白的不同,具体的加入时机还要根据实验来确定。

1. 2. 3 诱导物浓度

  诱导 pGEX 系列载体表达时所用的诱导物多为 IPTG,因其不会被细菌代谢而保持稳定的浓度,而被广泛选用。因其具有细胞毒性,使用时浓度不宜过高。PTG终浓度过高时,会在短时间内诱导出大量的融合蛋白,导致不正确的折叠就会形成包涵体,不利于获得可溶性蛋白。因此在实验中通常采用低浓度、长时间诱导表达的方式,以获取足够量的可溶性融合蛋白。

2、GST 标签对实验结果的影响

  虽然在大多数情况下认为 GST 标签不会对下游蛋白的折叠和功能造成影响,但 GST标签可能会影响蛋白的正确折叠 。因此对融合蛋白进行质量控制,会使实验结果更加可信。例如对折叠中的标签蛋白用核磁共振的方法进行检测,以确定其结构是否发生变化,或者是应用 X 射线晶体分析法检测标签蛋白结构上有无变化,再者就是结合其他的已知能发生相互作用的蛋白来对标签蛋白进行功能上的验证,以检测其结构或功能是否发生了变化,这些方法均可提高结果的可信度。

3、DNA 和 RNA 对实验结果的影响

  在做 pull down 实验时,我们有时会加入核酸酶来消除可能桥接到蛋白上的 DNA 和 RNA,这样会导致蛋白间相互作用出现假阳性。