GST pull-down 技术原理及实验流程

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  GST-Pull Down作为体外检测蛋白间直接互做的行之有效的方法,可用于证实预测的蛋白质-蛋白质相互作用的存在,也可用作未知的蛋白质-蛋白质相互作用的初始筛选测定法。

GST-Pull Down的原理

  GST Pull-Down实验基于GST(glutathione-S-transferase),即谷胱甘肽-S-转移酶蛋白,可以与谷胱甘肽(Glutathione,GSH)结合。将GSH固定于琼脂糖珠上,形成GSH-琼脂糖珠,将已知蛋白X与GST融合表达,获得的GST-X可与GSH-琼脂糖珠结合,若环境中存在与X蛋白互做的蛋白Y,则会形成“琼脂糖珠-GSH-GST-X-Y”复合物,与X蛋白互做的蛋白即可被分离并检测。

GST pull-down

GST Pull-Down实验方法
(基于钟鼎实验案例,验证预测的两个蛋白的互做)

实验设计

表1 Pull Down实验体系

编号 1 2 3 4
A-GST + - - +
B-His - + - +
GST - - + -

实验设计

1.IPTG诱导pET28a-B-His及pGEX-4T-1-A载体融合蛋白表达

1.1 表达载体转化至大肠杆菌Rosseta;
1.2 挑取转化平板上的单克隆接种于含50 μg/mL Amp的3 mL LB培养液的试管中,37℃摇菌过夜,制备种子液;
1.3 次日按1:100接种于50 μg/mL Amp的30 mL LB培养液中,37℃摇至菌体OD600为0.8;
1.4 向菌液中加入IPTG至终浓度为0.5 mM,11~28℃摇床培养,诱导融合蛋白表达4~8h;
1.5 将菌液离心弃上清,用 PBS重悬菌体沉淀,超声波破碎,离心取上清;
1.6 吸取少量上清用于SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。

2.细胞破碎及蛋白纯化
采用超声破碎,GST柱亲和纯化及Ni柱亲和纯化,分别获得纯化后的目的蛋白。

2.1 GST柱纯化

(1)利用低压层析系统,细胞裂解上清液上样至GST Binding-Buffer预平衡的GST亲和层析柱;
(2)用GST Binding-Buffer冲洗层析柱,至流出液OD280值到达基线;
(3)用GST Elution-Buffer洗脱目的蛋白,收集流出液;
(4)收集的蛋白溶液加入透析袋中,使用Tris-HCl透析过夜;
(5) 进行SDS-PAGE分析和WB分析。

2.2 Ni柱纯化

(1)利用低压层析系统,细胞裂解上清液上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose Cl-6B亲和层析柱;
(2)用Ni-IDA Binding-Buffer冲洗层析柱,至流出液OD280值到达基线;
(3)用Ni-IDA Washing-Buffer冲洗层析柱,至流出液OD280值到达基线;
(4)用Ni-IDA ELution-Buffer洗脱目的蛋白,收集流出液;
(5)收集的蛋白溶液加入透析袋中,使用Tris-HCl进行透析过夜;
(6) 进行SDS-PAGE分析和WB分析。

3.GST-Pull Down实验
使用GST Protein Interaction Pull-Down Kit (购自Thermo公司)

3.1平衡树脂(GST)

(1) 混匀Immobilized Glutathione,彻底重悬树脂;
(2) 各取100 µL 50% 树脂悬浮液到4个离心管中,1250 ×g离心2 min弃上清;
(3) 用500 µl PBS重悬树脂,1250 ×g离心2 min移除上清,重复3次。

3.2蛋白互作

(1) 按照按照表1分别将A-GST蛋白和B-His蛋白加入到谷胱甘肽树脂中,将混合物在4°C旋转混匀孵育过夜;
(2) 1250 ×g离心5 min后,弃上清(上清要取净);
(3) 用500 µL PBS重悬树脂。1250×g 离心2 min弃上清。重复3次。

3.3诱饵蛋白和靶蛋白复合物的洗脱

(1) 每管加入50 µL Elution Buffer;
(2) 4°C 旋转混匀孵育20 min;
(3) 1250 ×g 离心2 min弃上清,离心下来的液体置于冰上;
(4) 取20 µL样品进行SDS-PAGE和WB检测。