GST pull down 和 Co-IP的关系

GST pull down 和 Co-IP的关系 QQ技术支持

GST pull down和 Co-IP (Coimmunoprecipitation)是研究蛋白质相互作用的两种方法。两者的区别是,一个是直接自然发生的,一个是很难发生会对于发生条件有要求的。

打个比方:
  GST pull down 就像把一男一女放在孤岛上,同类男女之间该发生的一般都会发生。这种关系是直接的, 西方的。
  Co-IP则是,众里寻他千百度, 那人却在灯火阑珊处。一个蛋白在本性上可以同时喜欢很多其他的蛋白,但是最终还是会有个最喜欢的, 而在Co-ip中就能发现他的喜好。这种关系可能是直接的, 也可能是间接的,是更接近于东方的。

  免疫共沉淀的话蛋白质是处于天然状态,蛋白质的相互作用可以在天然状态下进行,可以避免认为影响,还可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。
  但是问题是两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;而且必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,如果抗体选错了就没有结果。

  GST pull-down是将GST融合蛋白作为探针固化到凝胶柱上,与溶液中的目的蛋白结合。可以用来确定融合(或探针)蛋白与未知(或靶)蛋白间的新的相互作用,证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用。
  但问题是这个方法可能会出现假阳性。也就是也许是因为电荷作用的影响造成的吸附,而不是生理性的相互作用。

有关Control和多方取证

  我们做试验,都要有实验组,对照组(阴/阳)。即使体外生化实验都达成了, 还要通过多方取证来确定两个蛋白之间确定的生理关系。
  尤其在蛋白实验里,假阴性,假阳性泛滥。如何辨别真伪? 需要靠缜密的阴性/ 阳性对照组来检验。
  要把蛋白和已知相干/不相干的蛋白放在一起,以此来检验实验手段是否能够区分这两种情况。通过移除一个蛋白,来看另一个蛋白的生理表现.,看它是不是专一的。
  在生物实验中, 单一的证据都是薄弱的,无论看起来多么合理正确,都要通过对照和多方取证才能确定真实的事实。

变化

  蛋白在细胞内从被产生,到被销毁,,并非一成不变,而是非常动态的。
  氧化、还原、去磷酸化、磷酸化,、去泛素化、泛素化、脂肪酸化、脱脂肪酸化等; 与其他蛋白或小分子物质的结合、分离;都会使蛋白的功能发生很大变化。
  两个蛋白的关系可能在这种情况下会这样,在那种情况下那样,有时候这些变化是可逆的,比如磷酸化。有时变化是不可逆的,比如氧化。
  细胞内ATP、GTP这些小分子也可能起到极大的作用,蛋白结合了他们就会变化, 蛋白的功能也会随之变化。如Ras,在结合了GTP以后就变得非常活泼, 可以引发细胞分化,形态变化。不过,Ras 若是持续的结合GTP不放手,那么细胞就会癌化。 因此,细胞内很多物质都能改变蛋白质特性。