GST蛋白相互作用pull down案例分析

蛋白A-GST和蛋白B-his、蛋白C-GST和蛋白D-his进行GST Pull-Down实验，来验证蛋白A-GST和蛋白B-his、蛋白C-GST和蛋白D-his是否具有相互作用。GST蛋白作为阴性对照。 实验具体分组可参考如下：

表一

编号	1	2
GST蛋白	+	-
A-GST	-	+
B-his	+	+

表二

编号	1	2
GST蛋白	+	-
C-GST	-	+
D-his	+	+

将Input组各样品与GST Magarose Beads反应后，用洗脱液洗脱后，进行WB鉴定，从而判断验证蛋白A-GST和蛋白B-his、蛋白C-GST和蛋白D-his是否存在互作。

1、试剂和耗材

一抗：GST、His抗体（钟鼎生物自制）
二抗：羊抗鼠-HRP（钟鼎生物自制）
Protein Marker
Acr、Bis、Tris
SDS
TEMED
GST Magarose Beads (钟鼎生物自制)
其它试剂均为国产分析纯

2、主要实验仪器

仪器名称	公司	仪器名称	公司	仪器名称	公司
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机	美国BECKMAN公司	台式高速离心机	德国SORVAL公司	Gel Doc2000成像系统、水平电泳系统	美国BIO-RAD公司
NANODROP2000	Thermo公司	320-S pH计	美国Mettler Toledo公司	AR5120电子天平	美国AHOM S公司
MultiTemp III 恒温水浴锅、Hofer ΜV-25紫外透射仪	美国Amersham Pharmacia公司	雪花状制冰机	日本SANYO公司	JY92-2D超声波细胞粉碎机	中国新芝科器研究所
Biologic LP层析系统	美国BIO-RAD公司	Mini Protean II垂直平板电泳系统	美国BIO-RAD公司	超净工作台	中国苏净集团

3、GST-Pull down实验

3.1 平衡树脂（GST）

(1) 混匀GST Magarose Beads，彻底重悬磁珠。
(2) 各取100 µL 50% 磁珠悬浮液到4个离心管中，2000 r/min离心2 min弃上清。
(3) 用500 µL PBS重悬磁珠，2000 r/min离心2 min移除上清，重复3次。

3.2 蛋白互作

(1) 按照方案设计表格加入相应的样品，并进行编号。混合后将平衡后的GST Magarose Beads分别加入到Input混合的样品中，在4℃旋转混匀孵育4 h。
(2) 2000r/min离心5 min，吸取上清。
(3) 用500 µL PBS洗涤磁珠，2000r/min离心2 min，弃上清，重复3次。

3.3 GST Magarose Beads洗脱

(1) 每管加入100 µL洗脱液。
(2) 4℃旋转混匀孵育30 min。
(3) 2000 r/min离心2 min取上清，置于冰上。
(4) 取20 µL样品进行WB检测。

3.4 Western Blot验证

(1) 取自备好的样品15% SDS-PAGE胶上样。
(2) 上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先100 V跑完积层胶，再将电压升至130 V直到电泳结束。
(3) 电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒流300 mA转膜，约为1h。
(4) 电转结束后，取下膜后先用PBST洗涤4次，每次5 min。
(5) 将膜置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭37℃ 1 h。
(6) 用PBST稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜。
(7) 次日将膜取出后用PBST 洗膜4次，每次5 min。
(8) (8)用含5%脱脂奶粉的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1 h。
(9) 反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5 min。
(10) ECL显影，曝光。

4、实验结果

Western Blot结果：

5、结果分析

蛋白A-GST和蛋白B-his、蛋白C-GST和蛋白D-his有相互作用。

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