琼脂糖凝胶电泳简介

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琼脂糖凝胶电泳介绍

琼脂糖凝胶电泳是凝胶电泳中最早使用的技术,但目前仍被广泛使用。琼脂糖凝胶电泳中的琼脂糖为半乳糖及其衍生物构成的中性物质,不带电荷,是一种天然的聚合长链状分子,同时可形成具有刚性的滤孔。

琼脂糖凝胶条带

琼脂糖凝胶电泳具有以下优点:

①对蛋白质吸附级微,故无拖尾现象。
②凝胶结构均匀,电泳区带整齐,分辨率高,重复性好;孔径较大,可用来分离酶的复合物、核酸。病毒等大分子物质。
③相与固相界面无明显界限,因此电泳速度快;
④不吸收紫外线,可以直接利用紫外光吸收法作定量测定;
⑤透明度较好,区带容易染色,样品易回收,利于制备。

带有地高辛标记的三磷酸脱氧尿甘(dUTP)通过缺口翻译、随机翻译或PCR等反应而使探针核酸片段带有地高辛,进一步可与带有AP、CSP等各种抗地高辛抗体复合物发生免疫反应,使探针上带有AP等分子,催化化学或发光反应。

对于目的DNA 或RNA 来说,分子杂交后,杂交部分可通过 ELISA 实验程序加以检测,显示出杂交部分。

琼脂糖凝胶电泳的缺点:

1、机械强度差,易破碎。  2、强酸性物质,易造成电渗。  3、易被细菌污染,不易保存。  4、琼脂糖支持层上的区带易扩散。

琼脂糖凝胶电泳分离DNA原理

DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。不同DNA分子量大小及构型不同,电泳时泳动率就不同。利用分子筛效应,迁移速度与分子量的对数值成反比关系分出不同的区带,分离DNA。
溴化乙锭(Ethidium Bromide,EB)在紫外光照下发散荧光,同时,EB可与DNA分子反应形成复合物,该复合物的荧光强度与DNA的含量成正比。因此,可以根据荧光强度估计样品DNA浓度。

实验试剂及仪器

琼脂糖、溴化乙锭、电泳仪、电泳槽等。

实验步骤

1、配置琼脂凝胶电泳的缓冲溶液。常用缓冲溶液的pH值为6~9, 离子强度为0.02~0.05,离子强度不宜过高,否则会析出盐的结晶,甚至使琼脂板断裂而中断电源。
2、制板。通常琼脂浓度为1%~1.5%,此浓度下的凝胶常常富有弹性、坚固不脆。琼脂放入水浴加热至熔化,在此环境下与等体积预热至60℃的缓冲液混合,继续加热至表面无气泡后,迅速将凝胶倒在水平玻璃板上,厚度约为3mm,冷却即可。
3、电泳加样。可使用挖槽法,在琼脂板的中央挖一长方形小槽,将在水浴上熔化至42~45℃的琼脂与样品等量混合,倒入小槽中,也可直接将样品倒入小槽中;还可以使用滤纸插入法,在琼脂板上适当的位置用刀片切一裂缝,插入蘸有样品的厚滤纸片,纸片的宽度与琼脂板厚度一致。
4、调节电压,固定和染色将电泳后的琼脂板浸入70%酒精配制的2%醋酸溶液中15~20分钟进行固定。固定后的琼脂板,需用自上而下为水漂洗数次,然后放在40℃左右的烘箱中烘干,这时琼脂板成一薄膜,附于玻璃板上,再以适当的显色剂显色。

DNA迁移速率决定因素

1、DNA分子大小:双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成正比
2、琼脂糖浓度:浓度越低,相同核酸分子迁移越快
3、DNA的构象(同一分子):超螺旋环状>线状>切口环状
4、凝胶缓冲液中所用试剂
5、琼脂糖种类;电泳缓冲液;电压等其他因素

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