琼脂糖凝胶电泳注意事项与常见问题解析

琼脂糖凝胶电泳是最基本的分子生物学实验技术之一,是southern杂交EMSA等实验的基础。其原理是:因为核酸是两性解离分子,在高于其等电点时,其磷酸基团全部解离,故在电泳缓冲液中带负电荷,加电时向正极迁移。琼脂糖形成的凝胶有许多网孔,发挥分子筛的功能。由于DNA的荷质比几乎固定,故DNA泳动的阻力与其大小及构象密切相关。本文将会介绍琼脂糖凝胶电泳的注意事项与常见问题解析。

琼脂糖凝胶电泳仪器

一、注意事项

(1)底板一定要用胶带封紧,否则灌胶时凝胶会漏出。可以在灌胶时先倒少量凝胶在交界处,利用凝固的凝胶将其封紧。
(2)梳子一定不能插到底部,应距离底部1-2mm,否则拔梳子时容易弄破凝胶,导致漏胶。
(3)加热时应注意不要让琼脂糖沸腾得太厉害,稍稍沸腾至溶液清凉,即其全部溶解即可,过度沸腾会导致凝胶实际浓度的提高。
(4)将凝胶放入电泳槽时要注意极性,不要正负极颠倒。要注意撕去两端的封带。
(5)凝胶的浓度与待分离的DNA的大小有关。一般浓度为1%,低浓度的胶特别易碎,要注意。
(6)溴酚蓝的迁移速率约与400-500bp的DNA相同。
(7)要防止强诱变剂EB的污染,还要注意对紫外线的防护。

二、常见问题

1.条带模糊

有几个可能原因:①DNA在某一步骤中已被降解,实验过程中要避免核酸酶的污染
②DNA上样量过多,导致“超载”。应减少凝胶中DNA上样量
③电泳设置条件不合理。电泳时电压不应超过20V/cm,温度<30℃;巨大DNA链电泳,温度应<15℃
④缓冲液失效,检查缓冲液是否有足够的缓冲能力

2.DNA条带弱或者没有DNA带

①DNA上样量不够,增加DNA的上样量;
②DNA走出凝胶,缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度;
③对于EB染色的DNA,所用光源不合适,应用短波长(254nm)的紫外光源

3.DNA带缺失

①分子大小相近的DNA带不宜分辨,增加电泳时间,核准正确的凝胶浓度;
②DNA链巨大,常规琼脂糖凝胶电泳不合适,可以尝试在脉冲凝胶电泳上分析。

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