RNA原位杂交技术原理与详细实验流程

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RNA原位杂交钟鼎生物技术支持

  近年来,RNA原位杂交技术经由不断地改进,比DNA原位杂交表现出了更广泛的应用前景,本文将会介绍RNA原位杂交技术的原理、详细实验流程以及一些实验注意事项。

1.RNA原位杂交原理

  RNA原位杂交是利用地高辛标记的反义RNA为探针,与切片杂交,从而原位的显示RNA的表达部位和相对丰度。RNA原位杂交是研究基因表达谱的重要方法。

2.RNA原位杂交实验流程

  RNA原位杂交的实验流程分为取材、固定、脱水、包埋、切片、探针合成、杂交,下面就来一一说明。

2.1.取材、固定、脱水、包埋、切片

(1)所有用得到玻璃器皿清洗干净,180°C烘6hrs,载玻片先用95%乙醇浸泡、 擦干净,再180°C烘6hrs;所用的试剂瓶需事先装DEPC·H20灭过菌;所用的固定液、乙醇溶液等都要用DEPC·H2O配制。   

(2)固定液配制

溶液 体积
50%FAA固定液 100ml
无水乙醇 50ml
37%甲醛溶液 10ml
冰乙酸 5ml
加DEPC·H2O定容至100ml
溶液 体积
70%FAA固定液 100ml
无水乙醇 70ml
37%甲醛溶液 10ml
冰乙酸 5ml
加DEPC·H2O定容至100ml

  50%FAA适用于幼穗、SAM等幼嫩组织的固定,70%FAA适用于根、茎秆、 叶片等成熟组织的固定。

(3)取材:将所需材料尽量剪小,加入预冷的FAA固定液中,固定液体积应不少于材料体积的10倍。固定液放冰上,抽真空15min,缓慢放气,再重复两次,直到材料沉底。

(4)固定:将抽完真空的固定液吸走弃去,换成新的固定液。4℃固定24hrs。

(5)脱水:如果是用50%FAA固定,先用50%乙醇洗掉固定液,换三次,每次30min;如果是用70%FAA固定,先用70%乙醇洗掉固定液,换三次,每次30min。然后梯度乙醇脱水(4℃)

乙醇溶液 时长
70%乙醇 至少1hr,可过夜,亦可长期保存
85%乙醇 1hr
95%乙醇(含伊红) 至少1hr,推荐过夜

(6)继续脱水和透明(室温)

溶液 时长
无水乙醇 1hr
无水乙醇 1hr
3/4体积无水乙醇+1/4体积二甲苯 1.5hrs
1/2体积无水乙醇+1/2体积二甲苯 1.5hrs
1/4体积无水乙醇+3/4体积二甲苯 1.5hrs
二甲苯 1hr
二甲苯 1hr

(7)浸蜡

溶液 温度 时长
二甲苯+碎蜡尽量多 42℃ 过夜
每8-12小时,继续补碎蜡 42℃ 2-3天
1/2体积二甲苯+1/2体积石蜡 48℃ 2hrs
1/4体积二甲苯+3/4体积石蜡 50℃ 2hrs
纯蜡 60℃ 1hr
纯蜡 60℃ 1hr
纯蜡 60℃ 1hr
纯蜡 60℃ 1hr

(8)包埋
  预先折好纸盒,并在电磁炉上熔化新的石蜡,置于60℃温箱中备用,注意包埋蜡温度不要过高,以免烫坏组织。包埋时,先铺一层包埋蜡,再将玻璃瓶中的材料倒进纸盒中,镊子稍加热,均匀排列材料(动作尽可能迅速,尤其是包埋蜡之后应尽快进行后续操作)。让材料自然冷却,可第二天再收。蜡块4℃可以保存很久。注意包埋蜡不要倒太多,蜡块厚度以1-2cm为宜,太厚不好切片。 纯蜡的温度可以提升至63度,防止操作过程中不迅速蜡块冷却凝固。

(9)切片前的准备
  切片盒先用碱水浸泡过夜,然后用DEPC·H2O洗净,42°C烘干
  用于原位杂交的载玻片必须保证无RNase,我们需要先用95%乙醇浸泡,然后再用干净的手帕擦干,用锡纸包裹后,180°C烘6hrs。如果载玻片本身很干净无浮尘,也可以直接180°C烘6hrs。但是如果载玻片不千净,会影响粘片和封 片。
  烘好后的玻片要涂上0.1% poly-L-lysine溶液。抹片方法:在超净台上,先铺一张干净的A4纸张,将载玻片正面朝上排列成两列摆在纸上(磨砂面方便用铅笔写字,为正面)。在其中一列载玻片中央加20μl poly-L-lysine,然后依次将滴有poly-L-lysine的和无poly-L-lysine的载玻片面对面涂抹均匀,注意不要有气泡,涂完后放置在干净的切片盒中。37℃烘干,至少1hr。

(10)切片
  切片前,依次用70%乙醇和DEPC·H2O擦干净切片台面、切片机、展片台。切片厚度一般为8-10μm。展片时,先滴1mlDEPC·H2O在载玻片上,选取需要的切片漂浮在DEPC·H2O水滴上。小心将载玻片转移到40℃左右的展片台,待切片展开就用枪吸走DEPC·H2O,再稍微在展开台的放置,甩掉剩余的DEPC·H2O,放入切片盒中。注意展片台温度不能过高,否则会产生气泡,破坏切片;展片时间也不能过久,超过5min会导致RNA降解。切好的切片37-42℃烘干1-2天,就可做原位杂交。切好的切片不能放置太久,最好其他步骤都准备好了再切片。

2.2.探针的设计与合成

  探针的设计与合成是整个原位杂交实验的重中之重,往往也是探针设计的不合理导致实验结果的不理想,这边可以参考(RNA原位杂交探针设计与合成实验步骤

2.3.杂交

  杂交这一步分三天做完,注意事项还是比较多的,这里受篇幅限制,我们另外讲解,请参考(RNA原位杂交实验中杂交步骤详解