RNA原位杂交探针设计原则与合成

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RNA原位杂交探针的设计与合成钟鼎生物技术支持

  前面介绍了RNA原位杂交技术的原理、详细实验流程以及一些实验注意事项。本文将会针对实验流程中探针的设计与合成进行详细说明,欢迎参考。

1.RNA原位杂交探针的设计原则:

a.探针的特异性要好,与其他基因匹配长度不要超过500bp;

b.用于杂交的探针长度为150-200bp,超过此长度的探针需要水解(见本页探针转录的碱水解),用于转录的模板不要超过1.5kb;

c.探针的GC含最最好在40-60%,没有连续的重复的碱基。

2.探针模板的克隆与线性化;

  将选取的cDNA片段扩增,克隆在含有T7、SP6启动子的载体上,如 P-GEM-T或p-GEM-TEasy载体上。线性化需要用5'突出末端的内切酶,如SalI和NcoI ,酶切的质粒量为20-50μg,酶切体系200μl,酶切时间2hrs至过夜。纯化前,需取1μl酶切产物跑胶检测,确定酶切完全。   

酶切结束,进行纯化,以确保模板没有RNase等杂质。纯化步骤如下:

a. 将酶切体系补水至500μl,向其加入250μl Tris饱和的苯酚和250μl CHCI3,震荡 5min,12000rpm离心5min.
b. 吸上层水相上清,转移至新管中,加500μl CHCI3,震荡5min,12000rpm 离心 5min.
c. 吸上清,转移至新管中,加1/10体积的3MNaAc (pH5.2,DEPC·H20配),2倍体积的无水乙醇,-20℃冷冻3hrs至过夜。
d. 4℃冷冻离心,12000rpm离心5min.
e.70%乙醇浸洗沉淀,去上清,吹干.
f.加20μl DEPC·H20溶解沉淀,测浓度。

3.RNA原位杂交探针的转录:

探针的转录所用的试剂均用DEPC·H20配制,转录的详细步骤如下:

转录体系:

转录体系
线性化的模板 1μg
10xTranscription Buffer 2μl
10xDIG RNA Labeling Mix 2μl
Ribonuclease Inhibitor (TaKaRa) 1μl
T7/SP6 RNA Polymerase 2μl

补充 DEPC·H20 至总体积20μl,37°C转录 2-2.5hrs。

b.DNaseI (invitrogen)2.5μl,37°C处理 15min,去掉DNA模板。
c.加 1pl〇_5MEDTA (pH 8.0)终止反应。
d.加2.5μl 4M LiCl和75μl无水乙醇,-20°C冷冻3hrs至过夜。
e.0℃冷冻离心,12000rpm离心20min。
f.去掉上清,加80%乙醇150μl浸洗,0°C冷冻离心,12000rpm离心20min。
g.小心吸走上清,超净台上吹干,加20-40μl DEPC·H20溶解。检测浓度,跑胶检测,-70°C保存。如果转录的探针长度合适,就此完成;如果长度过长,探针不易进入细胞,需要碱水解,继续往下进行。
h.碱水解的时间计算公式如下:
  T=(Lo-Lf)/(KxLoxLf)
  Lo:探针初始长度(Kb); Lf:探针终长度(Kb); K: 0.11 Kb/min.
  水解溶液为20μl 100mM NaHC03和30μl 100mM Na2C03,加在总体积为100μl。水解温度为60°C,水解时间按上述公式。

i.水解后加入5μl 10%冰乙酸,10μl 3M NaAc,2倍体积的无水乙醇,-20°C 冷冻3hrs至过夜。 j.0℃冷冻离心,12000rpm 离心 20min。 k.去掉上清,加80%乙醇150μl浸洗,0℃冷冻离心,12000rpm离心20min。 l.重复k。 m.小心吸走上清,超净台吹干。溶于20μl DEPC·H20,测浓度,跑胶检测。保存于-70°C。

4.RNA原位杂交探针方向的确定:

  用于原位杂交检测的探针是与体内mRNA互补的RNA,称为反义RNA;用于阴性对照的探针是与体内mRNA方向相同的,称为正义RNA。连接入 P-GEM-T或p-GEM-TEasy载体的cdna方向决定了探针的方向。

rna原位杂交探针方向

  此连接方向的话,用Nco I酶切、SP6转录酶转录的探针是反义RNA,用Sal I酶切、T7转录酶转录的探针是正义RNA。如果cDNA连接的方向相反,则探针方向也反过来。

以上便是RNA原位杂交中探针的设计原则及探针的合成过程,花这些篇幅来介绍,其重要性不言而喻,如果你有什么想法欢迎来与我们交流。